禽霍亂巴氏桿菌的分離鑒定與致病性研究

于成接，丁優(yōu)玲，華亞峰，金梅林，張安定

（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430070；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430070）

禽巴氏桿菌病又稱禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌所引起的雞、火雞、鴨、鵝等禽類的一種出血性、敗血性傳染病。各種家禽、野禽對(duì)多殺性巴氏桿菌均易感染，發(fā)病率和死亡率高。該病主要通過呼吸道、消化道及皮膚外傷感染發(fā)病，導(dǎo)致禽霍亂。本病于四季都可發(fā)生流行，高溫、多雨潮濕的環(huán)境易誘發(fā)。飼養(yǎng)管理不當(dāng)，如斷料、斷水或突然改變飼料等，都可提高家禽對(duì)禽霍亂的易感性［1］。

2011年10月廣西某雞場發(fā)生產(chǎn)蛋雞急性致死病例，發(fā)病率和死亡率都很高。有些病例病程非常短，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀即突然死亡，多數(shù)病雞呈急性癥狀，病雞精神沉郁，嗜睡，縮頸畏寒，羽毛松亂，食欲減少或不食，病雞口鼻有漿液性、黏液性分泌物流出，并伴咳嗽癥狀，最后昏迷痙攣而死亡。使用青霉素、慶大霉素等多種抗生素拌料、飲水治療無效，病情得不到控制，給養(yǎng)雞場造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了確診該病，我們選取了4只死亡時(shí)間在2h以內(nèi)的病死雞，進(jìn)行臨床剖檢、病原分離、鑒定以及致病性研究，確診該病的病原為對(duì)雞具有很高致病性的A型禽巴氏桿菌。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 TSA，TSB均為BD公司產(chǎn)品；麥康凱瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司；無支原體新生牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；TransTaq－T DNA Polymerase，dNTP，Trans2kPlus DNA Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA回收試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司；美藍(lán)、瑞氏、革蘭染料，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，美藍(lán)染液（每100mL染液含0．3g美藍(lán)，30mL 95%乙醇，終濃度0．01%的 KOH），瑞氏染液（0．1g瑞氏粉末研磨溶解于60mL甲醇），載玻片，購自武漢博士德生物工程有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1．2 慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢拉定、卡那霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、鏈霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、頭孢曲松、克林霉素、氨芐青霉素、阿米卡星、萬古霉素、阿奇霉素、林可霉素、阿莫西林、多黏菌素B、痢特靈、壯觀霉素的藥敏紙片，均購自杭州天和微生物制劑有限公司。

1．3 病雞剖檢 根據(jù)雞的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及常規(guī)剖檢步驟及方法進(jìn)行。組織觸片制作均在無菌超凈工作臺(tái)上操作，所有染色均參照獸醫(yī)微生物學(xué)的方法進(jìn)行［2］。

1．4 病原的分離培養(yǎng) 無菌采取病死雞的心、肝、肺的組織液，均分別劃線接種于TSA（含10%血清）平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基37℃恒溫箱培養(yǎng)，12h后觀察。

1．5 藥敏試驗(yàn) 用無菌棉拭紙蘸取菌液，于TSA（含10%血清）培養(yǎng)基表面均勻接種。平板置室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，各紙片中心相距大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm［3］。共測試22種藥物：慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢拉定、卡那霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、鏈霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、頭孢曲松、克林霉素、氨芐青霉素、阿米卡星、萬古霉素、阿奇霉素、林可霉素、阿莫西林、多黏菌素B、痢特靈、壯觀霉素。

1．6 PCR擴(kuò)增

1．6．1 16SrRNA 引物PCR擴(kuò)增及鑒定 以從肝、肺組織中分離培養(yǎng)得到的單菌落（用30μL滅菌超純水沖散，取其中5μL）為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，98℃預(yù)變性10min，（95℃30s；55℃30s；72℃1min 30s）30cycles，72℃10min，16℃1min。PCR體系：dNTP（2．5mmol／L）5μL，上下游引物（見表1）P1和P2各2μL（10μmol／L），10×TransTaq－T Buffer 5μL，TransTaq－T DNA Polymerase 1μL，模版5μL，加超純水至總體系為50μL。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1%）電泳，回收PCR產(chǎn)物（使用上海捷瑞生物工程有限公司的DNA回收試劑盒，按其說明書操作），片段大小為1 300bp左右，回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1．6．2 莢膜分型PCR鑒定 PCR模版來源同上，PCR體系：dNTP（2．5mmol／L）5μL，上下游引物（見表 1）各 1μL（10μmol／L），10×TransTaq－T Buffer 2．5μL，TransTaq－T DNA Polymerase 0．5 μL，模版5μL，加超純水至總體系為25μL。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測。所有PCR都設(shè)有陰性對(duì)照。

1．7 致病性試驗(yàn) 將所購買的10周齡健康雞只隨機(jī)分為7組，每組4只。購買后飼養(yǎng)1周，進(jìn)行分離菌致病性試驗(yàn)。各組雞均隔離飼養(yǎng)，飼料、飲水中不含任何抗生素。將從病料中分離純化的多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)在TSB（含10%血清）中，培養(yǎng)至OD600＝0．4。取出原菌液，用滅菌PBS稀釋至濃度為102～107CFU／100μL，分別取出100μL細(xì)菌懸液注射其中6組雞只的胸部肌肉內(nèi)。最后一組注射100μL滅菌PBS。所有濃度的細(xì)菌懸浮液均做了細(xì)菌回復(fù)計(jì)數(shù)，攻毒后，雞只正常飼養(yǎng)，觀察并記錄。

2 結(jié)果

2．1 病雞剖檢 4只臨床病死雞剖檢結(jié)果非常一致。均可見腹膜有小出血點(diǎn)，肝臟表面有針尖大小呈灰白色壞死點(diǎn)和出血點(diǎn)，脾臟腫大，十二指腸高度充血和出血，腸黏膜表面有粉紅色的黏液。心包有少量積液，心外膜及心冠脂肪有出血點(diǎn)，肺部充血、出血（見中插彩版圖1）。

2．2 細(xì)菌形態(tài)觀察 病死雞的肺臟、肝臟、心血觸片經(jīng)革蘭染色，鏡檢可見革蘭染色陰性的小桿菌，經(jīng)瑞氏染色鏡檢可見大量兩極濃染的短桿菌。鏡檢表現(xiàn)典型巴氏桿菌特征（見中插彩版圖2）。

2．3 病原分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性 無菌采取病死雞的肺臟、肝臟、心血，劃線培養(yǎng)于TSA（含10%血清）和麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，所有病料劃線培養(yǎng)于TSA培養(yǎng)基上均可見光滑、濕潤的水滴樣小菌落。在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上未見到菌落生長。取分離細(xì)菌革蘭染色，鏡檢可見革蘭染色陰性的小桿菌，經(jīng)瑞氏染色鏡檢可見大量兩極濃染的短桿菌。

2．4 16SrRNA序列分析 擴(kuò)增的16SrRNA片段大小約為1 300bp左右，經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，并使用在線工具BlastN（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行序列同源比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列與Pasteurellamultocidasubsp．multocida strain E348／08等多殺性巴氏桿菌的序列同源性最高，達(dá)98%。

2．5 莢膜分型鑒定 根據(jù) Townsend等［5－6］描述的方法，使用PCR方法對(duì)分離的巴氏桿菌進(jìn)行分型，只有A型Pm的引物PmA1，PmA2可擴(kuò)增出1 000 bp左右的條帶，符合預(yù)期的1 048bp片段大小，而其他組及陰性對(duì)照組均未擴(kuò)出任何條帶，表明該病原菌為莢膜血清A型，見圖3。

2．6 分離菌株的致病性試驗(yàn) 攻毒12h后，CFU為107、106組的所有雞只均急性發(fā)病死亡，除PBS組和CFU為102的組外，其他組出現(xiàn)不同程度的精神沉郁，嗜睡，縮頸畏寒，羽毛松亂，食欲減少，口鼻有漿液性，黏液性分泌物流出，并伴濕咳癥狀；1d后，CFU為105的組雞全部死亡，CFU為104的組死亡3只，另1只極度衰竭，呼吸困難；2d后，CFU為103的組出現(xiàn)兩只雞死亡，CFU為102的組臨床癥狀加重，PBS組正常；3d后，攻毒組雞只全部死亡，PBS組正常。試驗(yàn)結(jié)果表明，該病原菌毒力很強(qiáng)，即便攻毒劑量只有100CFU都能導(dǎo)致雞只感染后急性發(fā)病死亡。

2．7 藥敏試驗(yàn) 22種藥物測試結(jié)果顯示，該病原菌對(duì)慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢拉定、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、頭孢曲松、克林霉素、氨芐青霉素、阿米卡星、萬古霉素、阿奇霉素、林可霉素、阿莫西林、多黏菌素B、壯觀霉素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、痢特靈、氧氟沙星5種抗生素敏感。

3 小結(jié)與討論

禽巴氏桿菌病是由禽多殺性巴氏桿菌所引起的家禽和野禽的一種廣泛分布的接觸性傳染病。該病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重，禽類感染后常呈急性敗血性過程，發(fā)病率和死亡率高，在各地呈散發(fā)性或地方性流行。對(duì)于中小養(yǎng)雞場而言發(fā)病尤其嚴(yán)重，因此對(duì)禽巴氏桿菌病的診斷和防治是至關(guān)重要的。

2011年10月，廣西某雞場所在地區(qū)連日多雨，空氣潮濕，多個(gè)養(yǎng)雞場發(fā)生雞急性致死病例，雞群高度易感，病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁，縮頸閉眼，羽毛松亂，不愿走動(dòng)，離群呆立，呼吸困難，口鼻分泌物增加，并伴有濕咳癥狀，最后發(fā)生極度衰竭，昏迷麻痹而死亡。發(fā)病急，死亡快，病程1～3d。根據(jù)流行病學(xué)和病雞的臨床表現(xiàn)，疑似為禽巴氏桿菌病。

為了進(jìn)一步確診，我們選取幾只典型發(fā)病死亡的雞進(jìn)行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官的病理變化與禽巴氏桿菌病的特征性病理變化表現(xiàn)相符，進(jìn)一步的病原分離鑒定及染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)該病原在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)可見光滑、濕潤的水滴樣的小菌落，革蘭染色陰性、瑞氏染色兩極濃染，為球桿狀的小桿菌，該病原表現(xiàn)出典型巴氏桿菌的特征［7］。參照Marchesi J R等人使用1 6SrRNA的1對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序并進(jìn)行同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該核苷酸序列與多殺性巴氏桿菌的序列同源性達(dá)98%，再1次確證分離到的病原為禽多殺性巴氏桿菌。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)該病原進(jìn)行了莢膜分型，使用 Townsend等［5－6］描述的方法，鑒定該病原為莢膜血清型A型。

至此，我們認(rèn)為是A型禽多殺性巴氏桿菌引起了該雞場疾病的發(fā)生。為了探知該病原的致病力強(qiáng)弱，我們選取了10周齡的健康雞只進(jìn)行了分離菌的致病性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該病原菌致病、致死能力非常強(qiáng)。這一結(jié)果與該雞場的發(fā)病情況非常符合：雞只發(fā)病急、死亡率高，給雞場帶來很大的損失。

鑒于此種情況，迅速給出防治方案非常重要。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該病原耐藥譜廣，這與雞場使用抗生素拌料、飲水治療無效，病情得不到控制的情況相符，鑒于其對(duì)四環(huán)素、恩諾沙星藥物敏感，我們推薦雞場實(shí)行病雞隔離，帶雞消毒的措施，并在飲水和飼料中添加四環(huán)素、恩諾沙星藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，通過兩周的治療，雞場病情得到了有效控制。

［1］ 崔治中．獸醫(yī)全攻略－雞?。跰］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：206－210．

［2］ 陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué) ［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：19．

［3］ 孟丹，孟昱，張斌，等．耐藥性禽巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性檢驗(yàn)［J］．吉林畜牧獸醫(yī)，2009，30（11）：33－34．

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［7］ 李浩，劉陽，李長安．多殺性巴氏桿菌病研究進(jìn)展［J］．畜牧獸醫(yī)雜志，2011，30（2）：31－32．