48例傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒EB病毒核酸定量和異型淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室臨床意義

陳德林 潘麗

48例傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒EB病毒核酸定量和異型淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室臨床意義

陳德林 潘麗

目的研究傳染性單核細(xì)胞增多癥(以下簡(jiǎn)稱(chēng)傳單)患兒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中EB病毒DNA和異型淋巴細(xì)胞的輔助診斷的臨床意義。方法采取實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)來(lái)定量檢測(cè)EB病毒DNA的含量拷貝數(shù)(＞1.0×103為陽(yáng)性)和血液室異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)比例(＞4%為陽(yáng)性)。結(jié)果在48例傳單患者中，EB病毒DNA＞1.0×103(陽(yáng)性)40例，EB病毒DNA＜1.0×103(陰性)8例。異型淋巴細(xì)胞＞4%(陽(yáng)性)22例，異型淋巴細(xì)胞＜4%(陰性)26例。EB病毒DNA陽(yáng)性率占83.3%;異型淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率占45.8%。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)傳單患兒有較高的輔助診斷價(jià)值。結(jié)論EB病毒DNA定量拷貝數(shù)檢測(cè)有相當(dāng)高的診斷價(jià)值，為臨床提供傳單患者的快速診斷;異型淋巴細(xì)胞檢測(cè)具有45.8%陽(yáng)性輔助診斷價(jià)值，雖然輔助診斷價(jià)值沒(méi)有核酸檢測(cè)高，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，更適合不具備條件開(kāi)展分子生物實(shí)驗(yàn)室的基層醫(yī)院開(kāi)展輔助診斷傳單患者。

傳單患者;EB病毒DNA;異型淋巴細(xì)胞;相關(guān)性

皰疹病毒是一較大的囊膜的雙鏈DNA病毒，分為A群和B群兩個(gè)亞群。凡在體外培養(yǎng)時(shí)，容易從細(xì)胞內(nèi)釋放營(yíng)養(yǎng)液中的病毒為A群;病毒同細(xì)胞緊密結(jié)合，很難釋放到營(yíng)養(yǎng)液中的為B群。基因組結(jié)構(gòu)由末端重復(fù)序列和內(nèi)部重復(fù)序列組成，皰疹病毒基因可以整合于細(xì)胞的基因內(nèi)，成為細(xì)胞DNA的一部分，形成長(zhǎng)期潛伏感染狀態(tài)，皰疹病毒潛伏感染與腫瘤發(fā)生有關(guān)，尤其與鼻咽癌密切相關(guān)，EB病毒屬皰疹病毒4型，EB病毒感染可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥、鼻咽癌、兒童淋巴瘤。傳染性單核細(xì)胞增多癥是我國(guó)常見(jiàn)的幼兒傳染病，人群普遍易感，是由EB病毒引起的急性傳染病，EB病毒是一種嗜淋巴細(xì)胞病毒，70%淋巴細(xì)胞細(xì)胞增多，而且異型淋巴細(xì)胞明顯增多［1］，傳單患者大部分鼻咽部含有EB病毒。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有標(biāo)本均來(lái)自本院確診的病房患者和部分門(mén)診患者，由護(hù)理人員抽取患者靜脈血2～3 ml注入EDTA-K2抗凝管中送檢，用水平離心機(jī)1500r/min離心10 min編號(hào)待測(cè)。男性30人，女性18人;年齡最小6月，最大13歲，平均年齡4.1歲，且均為臨床上最后確診為傳染性單核細(xì)胞增多癥48例，其中EB病毒DNA定量拷貝數(shù)＞1.0×103(陽(yáng)性)40例，異淋巴細(xì)胞＞4%(陽(yáng)性)22例。

1.2 異淋巴細(xì)胞檢測(cè)儀器、試劑及方法 異型淋巴細(xì)胞檢測(cè)EDTA-K2抗凝全血用SYSMEX-2100血流流水線上自動(dòng)推片機(jī)進(jìn)行推片，自動(dòng)瑞士染液染色的血片，由經(jīng)驗(yàn)豐富的血液工作人員兩人共閱片求出的均值作為最后異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)值(＞4%為陽(yáng)性)。

1.3 EB病毒DNA定量檢測(cè)儀器、試劑及方法 使用羅氏(LightCycler?480)480PCR擴(kuò)增分析儀，采用中山大學(xué)達(dá)安基因試劑盒進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，方法為實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。質(zhì)量控制:查看陰性，陽(yáng)性及標(biāo)準(zhǔn)定值是否吻合決定此次檢測(cè)情況。陰性質(zhì)控品:增長(zhǎng)曲線不呈“3”型曲線或Ct=30，陽(yáng)性質(zhì)控品:增長(zhǎng)曲線呈“3”型線，且強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品定量參值在1.0×106～2.0×108范圍，臨界陽(yáng)性質(zhì)控品參考值在2.0×102～2.0×104IU/ml范圍(參考值為儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的數(shù)值)。陽(yáng)性定量參考品:全部陽(yáng)性，且線性相關(guān)系數(shù)0.97≤∣r∣≤1。測(cè)定結(jié)果有效必須具備以上質(zhì)控條件同時(shí)滿足，否則結(jié)果無(wú)效，需重做實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)EB病毒DNA靈敏檢測(cè)范圍在102～107拷貝/ml之間。

1.4 操作步驟

1.4.1 異型淋巴細(xì)胞檢測(cè)EDTA-K2抗凝全血充分混勻20次后，用SYSMEX-2100血液流水線上自動(dòng)推片機(jī)進(jìn)行推片，自動(dòng)瑞氏染液染色的血片，由經(jīng)驗(yàn)豐富的血液工作人員兩人共閱血片的體尾部細(xì)胞分布均勻的部位，求出的均值作為最后異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)值(＞4%為陽(yáng)性)。

1.4.2 EB病毒DNA的定量測(cè)定

1.4.2.1 DNA提取(標(biāo)本處理區(qū)) ①取1.5 ml滅菌離心管編號(hào)(與標(biāo)本同號(hào))。②取50 μl DNA提取液于1.5 ml滅菌離心管中，細(xì)心提取血清與血細(xì)胞交界處的白細(xì)胞層，盡量吸完放入滅菌離心管中，充分吹打混勻約靜置5 min。③振蕩器劇烈振蕩混勻5～10 s，置(100±1)℃恒溫金屬浴中孵育(10±1)min，12000r/min離心5 min備用。

1.4.2.2 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū)) ①?gòu)谋渲腥〕鯡B病毒DNA檢測(cè)試劑，室溫解凍，取0.2 ml樣品擴(kuò)增八連管，按比例加入EB病毒DNA-PCR反應(yīng)液40 μl+Taq酶3 μl/人份至八連管中。②將加好試劑的擴(kuò)增八連管放入試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本處理區(qū)之間的傳遞窗中。③加樣:在標(biāo)本處理區(qū)從傳遞窗中取出加好試劑的八連管于生物安全柜中加樣，分別依次加入處理好的標(biāo)本上清液2 μl，陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品后，蓋上密封條密閉，8000 r/min離心數(shù)秒。④將處理好的樣本放入標(biāo)本處理區(qū)和擴(kuò)增區(qū)之間的傳遞窗中，準(zhǔn)備擴(kuò)增。

1.4.2.3 樣品擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增區(qū)) ①打開(kāi)擴(kuò)增區(qū)電腦及LightCycler?480主機(jī)，查看反應(yīng)條件是否吻合，否則重新設(shè)置。②從傳遞窗中取出準(zhǔn)備好的樣品擴(kuò)增管，放入LightCycler?480主機(jī)儀器擴(kuò)增板內(nèi)，再放進(jìn)LightCycler?480主機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 異型淋巴細(xì)胞＞4%(陽(yáng)性組)的22例，EB病毒DNA檢測(cè)值＞1.0×103(陽(yáng)性組)標(biāo)本40例，見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在臨床確診的傳染性單核細(xì)胞增多癥48例患者中，EB病毒DNA定量核酸檢測(cè)陽(yáng)性達(dá)83.3%，由于核酸檢測(cè)速度快，使用EDTA-K2抗凝全血采樣方便，對(duì)傳染性單核細(xì)胞增多癥患者有非常高的早期診斷價(jià)值，EDTA-K2抗凝全血涂片查異型淋巴細(xì)胞對(duì)傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷陽(yáng)性率也高達(dá)45.8%(高于文獻(xiàn)2所述［2］)，此次研究發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA定量核酸檢測(cè)明顯高于血涂片查異型淋巴細(xì)胞對(duì)傳染性單核細(xì)胞增多癥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法處理 t檢驗(yàn)。

表1 EB病毒核酸定量和異型淋巴細(xì)胞相關(guān)性比較［例數(shù)(%)］

3 討論

】EB病毒感染引起的傳染病，人員普遍易感，EB病毒(EBV)幾乎與所有鼻咽癌有關(guān);EB病毒(EBV)對(duì)診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥至關(guān)重要;EB病毒(EBV)還同Burkitt淋巴瘤、免疫損傷性患者的淋巴瘤有關(guān);EB病毒(EBV)同時(shí)也可能與何杰金氏病(Hodgkinsdisease)、慢性疲勞綜合征、移植后淋巴組織增生癥等有關(guān);檢測(cè) EBV病毒的PCR(EBVDNA)，PCR熒光定量技術(shù)可從少量標(biāo)本中擴(kuò)增檢測(cè)出所需DNA，適用于多種不同標(biāo)本的檢測(cè)。為臨床檢測(cè)、普查EBV提供快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段。

本次檢測(cè)的均為臨床確診的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者，傳染性單核細(xì)胞增多癥是由EB病毒感染引起的傳染病，人員普遍易感。EB病毒(EBV)核酸檢測(cè)對(duì)診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥至關(guān)重要，本次是EDTA-K2抗凝全血提白細(xì)胞層檢測(cè)核酸檢測(cè)，陽(yáng)性率高達(dá)83.3%高于文獻(xiàn)3中所述［3］，而且具有采樣方便，檢測(cè)時(shí)間快;可能陽(yáng)性率更高，非常高的早期診斷價(jià)值診斷價(jià)值。此次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沒(méi)有取鼻咽部分泌物進(jìn)行核酸檢測(cè)，傳染性單核細(xì)胞增多癥患者大部分鼻咽部含有EB病毒，采樣更方便，可能陽(yáng)性率更高。

EB病毒是一種嗜淋巴細(xì)胞病毒，70%傳染性單核細(xì)胞增多癥患者淋巴細(xì)胞細(xì)胞增多，而且異型淋巴細(xì)胞也明顯增多，可見(jiàn)異型淋巴細(xì)胞也是實(shí)驗(yàn)室輔助診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥的重要方法，陽(yáng)性率45.8%高于文獻(xiàn)4中所述［4］。雖然不如核酸檢測(cè)陽(yáng)性率的臨床意義大。但是對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求不高，適合于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室，更適合于不具備條件開(kāi)展PCR核酸檢測(cè)的醫(yī)院輔助診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥。

［1］ 陳尚明，黃海英.小兒傳染性單核細(xì)胞增多癥72例臨床分析.南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29(4):305 －307.

［2］ 陸丹，胡興文，曾菊.兒童EB病毒感染與異型淋巴細(xì)胞相關(guān)性分析，中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(12):1732 －1734.

［3］ 于謹(jǐn)銘，羅兵，李詠梅，等.EBV-DNA檢測(cè)在兒童EB病毒感染中的臨床意義.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2012，23(5):8－10.

［4］ 劉瑩，曹軍皓，容東寧，等.傳染性單核細(xì)胞增多癥.異型淋巴細(xì)胞數(shù)量與EB病毒濃度的關(guān)系.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(20):3582－3583.

563000 遵義市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科