TLR4與抗磷脂綜合征血栓形成研究進(jìn)展①

解鴻翔 周 紅

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212013)

抗磷脂綜合征 (Antiphospholipid syndrome，APS)為一種非器官特異性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性動(dòng)靜脈血栓、習(xí)慣性流產(chǎn)和血小板減少等［1］，其中血栓形成是APS的主要病理基礎(chǔ)和最突出臨床表現(xiàn)，也是造成患者死亡的重要原因。前瞻性研究表明，雖然經(jīng)過(guò)反復(fù)的抗凝治療，但APS患者仍然有顯著的發(fā)病率和死亡率［2］。本文對(duì)TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在APS血栓形成中作用做一綜述，以期對(duì)APS病理機(jī)制有更好的理解，為APS治療提供新的方法。

1 TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)途徑

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是與微生物識(shí)別有關(guān)的天然免疫受體家族，屬模式識(shí)別受體，分布廣泛。TLR不僅通過(guò)選擇性地識(shí)別病原體中病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的保守結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵病原體的早期識(shí)別，激活天然免疫，還可提供刺激分子和誘導(dǎo)T細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，幫助機(jī)體建立獲得性免疫［3］。至今在人類已發(fā)現(xiàn) 11種 TLRs(TLR1～TLR11)，TLR4是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的人類Toll樣受體蛋白。

TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)三個(gè)部分組成。其胞外區(qū)結(jié)構(gòu)有富含亮氨酸的重復(fù)序列，負(fù)責(zé)識(shí)別不同的配體;胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)相似，負(fù)責(zé)受體活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中TIR區(qū)域是TLR4與其下游相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用的關(guān)鍵部位。

目前已知TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括MyD88依賴性和非依賴性途徑。TLR4與配體結(jié)合后發(fā)生二聚化，在MD-2分子的參與下，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并募集下游的信號(hào)蛋白MyD88。MyD88通過(guò)其羧基(C)端與TLR4的TIR區(qū)發(fā)生同源性相互作用，其氨基(N)端的死亡結(jié)構(gòu)域又招募IRAK4、未磷酸化的IRAK1，使兩者形成復(fù)合物，引起 IRAK1活化和 IRAK4自身磷酸化。隨后此復(fù)合物從MyD88上解離，與具有E3泛素連接酶活性的TRAF6相互作用。TRAF6與泛素結(jié)合酶13(Ubiquitin-conjugating enzyme 13，Ubc13)、泛素結(jié)合酶 E2變體1亞型 A(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1 isoform A，Uev1A)結(jié)合，促使63位賴氨酸連接的多聚泛素鏈的合成，導(dǎo)致TAK1的激活。TAK1與TAB1(TAK1-binding protein 1)、TAB2(TAK1-binding protein 2)形成復(fù)合體，經(jīng)IκB激酶(IKK1-IKK2-IKKγ)磷酸化激活NF-κB或經(jīng)p38、JNK等促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)途經(jīng)活化激活蛋白-1(Activator protein，AP-1)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干擾素(Interferon，IFN)和粘附分子等基因的表達(dá)［3，4］。TRIF 是TLR4激活后TIR結(jié)構(gòu)域募集的另一接頭蛋白，其介導(dǎo)的信號(hào)途徑又稱MyD88非依賴途徑或TRIF依賴途徑。TRIF分子通過(guò)250-255位氨基酸構(gòu)成的T6BM結(jié)構(gòu)域和661-699位氨基酸構(gòu)成的RHIM結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合TRAF6和RIP1(Receptor-interacting protein 1)，后兩者可獨(dú)立介導(dǎo) TRIF途徑的NF-κB激活過(guò)程。TRIF與RIP1結(jié)合后還可以通過(guò)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas associated death domain，F(xiàn)ADD)，活化caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，TRIF也可以與TBK-1及IKKε結(jié)合，后兩者可作為IRF3的激酶使IRF3活化，誘導(dǎo)包括IFN-β在內(nèi)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄。

TLR4主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，以骨髓單核細(xì)胞的表達(dá)為多。TLR4作為人類天然免疫的重要受體，可以識(shí)別多種配體，最主要的是來(lái)源于細(xì)菌的脂多糖(LPS)，此外還能識(shí)別呼吸道合胞病毒蛋白F、分枝桿菌成分、熱休克蛋白、纖維結(jié)合蛋白、肝素、透明質(zhì)酸酶、纖維蛋白原等。作為調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的重要分子，在特定條件下，TLR4可異常高表達(dá)并過(guò)度激活，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂，引發(fā)各種疾病，包括自身免疫性疾病。

2 β2GPI與細(xì)胞表面受體

大量研究表明，APS患者血清中的高滴度的抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，aPL)與其病理機(jī)制密切相關(guān)。但aPL針對(duì)的靶抗原不是磷脂，而是一大類吸附于陰離子表面的磷脂結(jié)合蛋白，其中β2糖蛋白I(beta-2-glycoprotein I，β2GPI)是aPL的關(guān)鍵靶抗原。臨床研究顯示多數(shù)反復(fù)發(fā)生血栓的患者可檢測(cè)到抗β2GPI抗體，經(jīng)親和純化的APS患者來(lái)源的抗β2GPI抗體能誘導(dǎo)小鼠血栓形成［5，6］。抗β2GPI抗體可通過(guò)β2GPI依賴的方式激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其上調(diào)細(xì)胞粘附分子(E-selectin、ICAM-1、VCAM-1)的表達(dá)，分泌和釋放促炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α)和組織因子(Tissue factor，TF)等，也可以刺激血液?jiǎn)魏思?xì)胞分泌炎癥因子和表達(dá)TF［7-10］。其中TF在APS血栓形成中扮演關(guān)鍵角色。TF為貫穿于細(xì)胞膜的單鏈糖蛋白，可以作為凝血因子Ⅶ/Ⅶa的受體，以TF/Ⅶa復(fù)合物的形式激活凝血因子Ⅸ、Ⅹ，從而引發(fā)血液凝固。

過(guò)去的研究表明，β2GPI不是簡(jiǎn)單的綁定細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的磷脂，而是通過(guò)特殊的受體結(jié)合到細(xì)胞表面。體內(nèi)和體外研究表明膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)是β2GPI的高親和力受體，將β2GPI連接在靶細(xì)胞上，介導(dǎo)aPL誘導(dǎo)的病理效應(yīng)［11-13］。Annexin A2，內(nèi)皮細(xì)胞表面組織型凝血酶原激活物的受體，是一種無(wú)跨膜區(qū)域的膜蛋白，不能單獨(dú)誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)通路。因此Annexin A2可能需要一種可以誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)的“銜接蛋白”(或共受體)。近期研究發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白TLR4可能充當(dāng)這種角色。

3 TLR4與aPL誘導(dǎo)的細(xì)胞激活:體外研究

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞 Raschi等［14］人運(yùn)用內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC-1研究發(fā)現(xiàn)，APS病人來(lái)源的抗β2GPI單克隆抗體和經(jīng)過(guò)抗原純化的抗β2GPI多克隆抗體與LPS或IL-1激活內(nèi)皮細(xì)胞后具有相同的信號(hào)通路。MyD88或 TRAF6敲除之后，抗 β2GPI抗體與 LPS或IL-1失去誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活化的能力，對(duì)IRAK磷酸化研究顯示LPS和抗β2GPI抗體具有相同時(shí)間動(dòng)態(tài)。Raschi等的研究結(jié)果說(shuō)明β2GPI抗原抗體復(fù)合物綁定內(nèi)皮細(xì)胞后，可通過(guò)與Toll樣受體(TLR)有關(guān)的MyD88依賴途徑導(dǎo)致NF-κB活化，并提示有可能是TLR4在信號(hào)通路中起到關(guān)鍵的作用。

這些數(shù)據(jù)并沒(méi)有證明TLR4直接綁定β2GPI，還是由于其它細(xì)胞表面受體與β2GPI結(jié)合，TLR4作為共受體激發(fā)胞內(nèi)信號(hào)通路。Zhang等［15］在隨后的實(shí)驗(yàn)中將內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC來(lái)源的Annexin A2經(jīng)親和純化后固定在Affi-Gel HZ柱上，通過(guò)洗脫、SDS-PAGE和LC-MS分析后發(fā)現(xiàn)TLR4能與Annexin A2發(fā)生免疫共沉淀。這些發(fā)現(xiàn)初步證實(shí)TLR4可能參與Annexin A2介導(dǎo)β2GPI抗原抗體復(fù)合物激活內(nèi)皮細(xì)胞。

最近，Allen等［16］進(jìn)一步證實(shí)TLR4在抗β2GPI抗體激活內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。TLR4可以和Annexin A2、calreticulin及 nucleolin以多聚蛋白信號(hào)復(fù)合體的形式存在于在靜息的HUVEC表面，在羊抗人β2GPI抗體激活HUVEC過(guò)程中多聚蛋白信號(hào)復(fù)合體表達(dá)增加，通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲除此多聚蛋白信號(hào)復(fù)合體中任一蛋白的表達(dá)，均會(huì)明顯抑制抗β2GPI抗體誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞 E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、TF mRNA 表達(dá)及 NF-κB 活化。然而Calreticulin和nucleolin在抗β2GPI抗體激活內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中的具體生物學(xué)功能并不清楚。

3.2 單核細(xì)胞 抗β2GPI抗體激活內(nèi)皮細(xì)胞是APS血栓病理形成機(jī)制的其中一個(gè)假說(shuō)［17］。單核細(xì)胞表面也存在抗β2GPI抗體，它通過(guò)Annexin A2和TLR4作為受體進(jìn)行交叉反應(yīng)。Sorice等［10］研究表明靜息狀態(tài)下的人單核細(xì)胞脂筏內(nèi)，β2GPI以二聚體的形式與Annexin A2相互結(jié)合。LPS或來(lái)源于有血栓史APS病人血漿的抗β2GPI抗體激活單核細(xì)胞后，TLR4也被招募進(jìn)脂筏并與β2GPI二聚體相互作用，β2GPI發(fā)生二聚化并且與被招募進(jìn)脂筏的TLR4相互作用，導(dǎo)致IRAK磷酸化和NF-κB轉(zhuǎn)位，最終導(dǎo)致細(xì)胞釋放TNF-α和TF，引起促炎癥反應(yīng)和血液高凝。TLR4與β2GPI結(jié)合需要脂筏的完整性，脂筏破裂劑 mβCD可以減少 TLR4與β2GPI結(jié)合，抑制抗 β2GPI抗體誘導(dǎo)的 IRAK磷酸化。

本課題組對(duì)于TLR4在抗β2GPI抗體激活單核細(xì)胞中的作用進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)中用兔抗體人β2GPI抗體刺激人單核細(xì)胞株THP-1，并加入外源性人β2GPI共同孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β2GPI抗原抗體復(fù)合物能夠產(chǎn)生與LPS相同的刺激效應(yīng)，顯著增加細(xì)胞 TLR4、MD-2和 MyD88 mRNA及蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)IRAK1磷酸化和TRAF6泛素化，最終導(dǎo)致TF mRNA 表達(dá)增強(qiáng)、活性增高［18，19］。為充分闡明TLR4及其信號(hào)分子在β2GPI抗原抗體復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)TF中的作用，我們還采用TLR4途徑抑制劑--紫杉醇，觀察對(duì)細(xì)胞表達(dá)上述分子的影響。紫杉醇(paclitaxel)是一種常見(jiàn)的抗癌藥，可以通過(guò)與MD-2結(jié)合，掩蓋TLR4配體的受體結(jié)合位點(diǎn)而起到抑制 TLR4信號(hào)通路的作用［20，21］。利用紫杉醇這一特性，觀察紫杉醇是否干預(yù)β2GPI抗原抗體復(fù)合物對(duì)THP-1細(xì)胞的作用。結(jié)果證明，紫杉醇不僅抑制了β2GPI抗原抗體復(fù)合物誘導(dǎo)的TLR4、MD-2、MyD88表達(dá)，也抑制了 IRAK1磷酸化和TRAF6泛素化，同時(shí)也干預(yù)了細(xì)胞TF的表達(dá)。

我們通過(guò)β2GPI-Affi-Gel柱親和層析證明Annexin A2和TLR4均可以與β2GPI在THP-1細(xì)胞表面發(fā)生結(jié)合。慢病毒 LV-Annexin A2-RNAi干擾THP-1細(xì)胞后，β2GPI抗原抗體復(fù)合物刺激細(xì)胞TLR4、MyD88及MD-2表達(dá)的作用明顯減弱，IRAKs和TRAFs表達(dá)和活性被抑制，最終也干預(yù)了細(xì)胞TF的表達(dá)。我們認(rèn)為THP-1細(xì)胞表面TLR4部分依賴Annexin A2，在β2GPI抗原抗體復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF過(guò)程發(fā)揮重要作用［18，19］。

4 TLR4與aPL誘導(dǎo)的血栓:體內(nèi)研究

為了證實(shí)TLR4在aPL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活和體內(nèi)血栓形成中的作用，Pierangeli等［22］觀察了aPL誘導(dǎo)LPS非反應(yīng)性小鼠(C3H/HeJ小鼠)血栓形成的能力。C3H/HeJ小鼠細(xì)胞由于編碼TLR4胞內(nèi)段的基因區(qū)發(fā)生錯(cuò)意點(diǎn)突變而不能對(duì)LPS作出反應(yīng)。與健康患者IgG片段和aPL陰性SLE患者IgG片段相比，APS患者中的IgG片段引起LPS+/+小鼠產(chǎn)生更大的血栓，小鼠提睪肌微循環(huán)中的內(nèi)皮細(xì)胞上黏附了更多白細(xì)胞。這些效應(yīng)通過(guò)親和層析去除抗β2GPI活性后消失。與 LPS+/+小鼠小相比，LPS-/-小鼠注射IgG-APS后產(chǎn)生更小的血塊，黏附更少的白細(xì)胞，頸動(dòng)脈勻漿中產(chǎn)生更少的TF。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地說(shuō)明了aPL介導(dǎo)的血栓形成效應(yīng)，aPL特別是抗β2GPI在體內(nèi)能激活內(nèi)皮細(xì)胞，TLR4基因自發(fā)突變導(dǎo)致的細(xì)胞信號(hào)通路缺陷能顯著降低aPL誘導(dǎo)血栓效應(yīng)。

5 二次打擊理論與TLR4的保護(hù)性基因多態(tài)性

雖然APS被認(rèn)為是一種自身抗體介導(dǎo)的疾病，抗磷脂抗體在APS中起主要作用，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，APS患者血液中持續(xù)表達(dá)aPL，而血栓形成只是偶爾發(fā)生。因此提出二次打擊理論，認(rèn)為aPL形成的第一次打擊是血栓形成的高危因素，而臨床血栓發(fā)生還需要其他條件形成二次打擊。

前期的實(shí)驗(yàn)表明aPL誘導(dǎo)的APS動(dòng)物模型發(fā)生血栓需要炎癥形成的再擊效應(yīng)，如機(jī)械創(chuàng)傷和注射 LPS［22，23］。APS 患者急性血栓形成通常和近期感染有關(guān)。研究表明LPS能增強(qiáng)aPL誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)L-選擇素、IL-8，并能與 β2GPI結(jié)合導(dǎo)致TLR4依賴的巨噬細(xì)胞活化［24，25］。這些證據(jù)表明炎癥作為第二種致?lián)粑?，引發(fā)aPL相關(guān)的血栓事件發(fā)生。TLR4對(duì)誘導(dǎo)快速炎癥反應(yīng)和激活免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞起到關(guān)鍵作用。由于TLR4基因多態(tài)性可能減弱對(duì)配體的快速反應(yīng)，在細(xì)胞水平減弱炎癥應(yīng)答，從而改變感染性疾病和炎癥性疾病的易感性［26］。

“保護(hù)性”的TLR4單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)同樣導(dǎo)致APS病人aPL誘導(dǎo)血栓形成效應(yīng)的不同易感性。Pierangeli［22］的數(shù)據(jù)顯示有血栓史的APS患者TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile突變的頻率顯著低于有同樣突變的健康質(zhì)控。Cimaz等［27］調(diào)查了 IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6、IFNγ、IL-10和TLR4基因多態(tài)性的家族分布。非保護(hù)性野生型TLR4基因和高促炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子多態(tài)性(IL-1β promoter-511 C/T;TNF-α G/A;TGFβ +10 T/C，+25 C/G;IL-6-174 C/G)僅存在于反復(fù)發(fā)生血栓的先證者，而保護(hù)性TLR4基因多態(tài)性更多的出現(xiàn)在無(wú)癥狀的aPL攜帶者?？傊?，APS患者炎癥反應(yīng)中的保護(hù)性TLR4基因多態(tài)性將減少炎癥因子激發(fā)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，使aPL陽(yáng)性患者發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)性降低。

6 TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)阻斷研究與APS治療

目前針對(duì)APS的治療，主要是依賴長(zhǎng)期的抗凝防止血栓發(fā)生，及孕期使用肝素和阿司匹林防止流產(chǎn)。這些治療并非有效，有出血等副作用，因此迫切需要新的治療方法，特異性干預(yù)APS病理過(guò)程。隨著對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在APS發(fā)病機(jī)制中的作用的不斷深入，在治療方面除傳統(tǒng)藥物外，抑制此通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)或關(guān)鍵分子以抑制APS病人的血栓發(fā)生是眾多學(xué)者研究的新方向。

體外實(shí)驗(yàn)表明，β2GPI和TLR4間的交叉反應(yīng)在誘導(dǎo)細(xì)胞激活和APS促凝血表型中起關(guān)鍵作用，脂筏破裂劑mβCD、TLR4封閉抗體和TLR4干擾RNA等任何可以介入該機(jī)制的方法均可用于阻斷或降低aPL介導(dǎo)的“第一次打擊”，阻斷或減少aPL誘導(dǎo)的血栓效應(yīng)和炎癥反應(yīng)［10，16，28］。TLR4 下游重要的信號(hào)分子MyD88、IRAK1和 TRAF6在 APS中的作用也已經(jīng)證明，抑制這些關(guān)鍵分子的表達(dá)或活性，同樣可以阻斷aPL誘導(dǎo)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終減少TF表達(dá)［2，29，30］。

MAPK途徑和NF-κB途徑作為包括TLR4信號(hào)通路在內(nèi)的多條信號(hào)通路的終末途徑，在APS病理機(jī)制中的關(guān)鍵角色在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都已得到證實(shí)，其中P38 MAPK、ERK1/2參與aPL誘導(dǎo)的血小板和多種細(xì)胞的激活，而JNK的作用尚無(wú)定論［31］。雖然小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制 P38 MAPK、NF-κB能顯著減少aPL誘導(dǎo)的血栓發(fā)生，但由于MAPK途徑和NF-κB途徑存在復(fù)雜的調(diào)控，臨床治療的長(zhǎng)期有效性還需進(jìn)一步觀察。由于APS患者需要長(zhǎng)期抗凝治療，TLR4作為固有免疫的重要防線，因此在進(jìn)行針對(duì)TLR4及其信號(hào)途徑的免疫治療時(shí)，還要考慮治療的安全性。APS患者aPL介導(dǎo)的血栓發(fā)生與TLR4基因多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，因此TLR4多態(tài)性分析可以作為一種新工具對(duì)APS患者發(fā)生血栓的可能性重新評(píng)估，并以此調(diào)整抗凝藥物的用量。

7 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，TLR4在APS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，為深入闡明該病的發(fā)病機(jī)制和拓展治療方法提供了新的方向。TLR4的研究仍然存在許多問(wèn)題，目前主要局限于基礎(chǔ)研究，真正能應(yīng)用于臨床的成果尚少，如何提高APS血栓和流產(chǎn)的防治效果并研究新的治療方案有待進(jìn)一步探討。

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