精密肝切片技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用

周 璐， 喬靜怡， 金若敏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心，上海201203)

肝臟含有的豐富的代謝酶，是外源性物質(zhì)體內(nèi)代謝和處置的重要場所?？紤]到肝臟結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和肝代謝、生物轉(zhuǎn)化、內(nèi)分泌等功能的多樣性，人們設(shè)計出了肝細(xì)胞體外培養(yǎng)、肝微粒體培養(yǎng)、肝臟灌流等［1-3］多種體外模型用于肝臟的研究。作為研究肝臟所有細(xì)胞類型相互作用的模型——肝精密切片 (precision-cut liver slice，簡稱肝切片)于1923年由Warburg首先提出并開始加以應(yīng)用。下面對這一技術(shù)的特點和應(yīng)用加以概述。

1 精密肝切片的制備及特點

1.1 精密肝切片的制備 將大鼠或其他實驗動物處死后，在無菌環(huán)境下取出肝臟，并立即用4℃預(yù)冷的含氧量為95%O2×5%CO2的DMEM培養(yǎng)液沖洗去殘余血跡。用手持打孔器取10 mm×10 mm2大小的組織塊放入含有緩沖液的Krumdieck切片機(jī)的標(biāo)本槽中進(jìn)行切片，切片的厚度為250～300μm，厚度太厚 (＞500μm)會限制氧的擴(kuò)散使肝切片出現(xiàn)缺血性損傷;太薄 (＜200μm)則使切片中損傷的細(xì)胞所占比例過大。整個切制過程均應(yīng)在4℃左右的無菌環(huán)境下操作，以降低肝細(xì)胞的代謝功能及避免潛在的氧化損傷。如果需進(jìn)行長時間的培養(yǎng)也可在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素。

肝切片培養(yǎng)的常見方法分為兩類:一類為靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，即將肝切片置于含適量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每瓶1片，37℃、水浴振蕩密閉培養(yǎng)，在該培養(yǎng)系統(tǒng)中肝切片的活性可保持3 h左右。另一類為動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，肝切片放入一個盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉(zhuǎn)器上，在37℃下以一定轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，在此培養(yǎng)系統(tǒng)中肝切片的活性可延長至20 h。培養(yǎng)后，應(yīng)用高效液相等技術(shù)檢測培養(yǎng)基中各項功能指標(biāo)的變化，將肝切片制成組織勻漿以檢測其中酶的活性和基因的表達(dá)，或置于福爾馬林中固定，制成病理切片，觀察組織學(xué)的變化［1-4］。

1.2 精密肝切片的特點 肝切片是一項介于器官與細(xì)胞水平之間的體外培養(yǎng)技術(shù)，早期由于技術(shù)的限制，該技術(shù)存在可重復(fù)性差和培養(yǎng)維持時間短等缺點，在當(dāng)時并不被人們所認(rèn)可。直到1986年Krumdieck等提出了動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)和Krumdieck組織切片機(jī)的出現(xiàn)。使得快速大量制備均一肝切片并維持長時間活性成為可能［5］。與其他體外培養(yǎng)技術(shù)相比，肝切片能夠更好的模擬肝臟的體內(nèi)環(huán)境，并可直觀觀察藥物的代謝、藥物所誘導(dǎo)的酶的變化和組織學(xué)的改變，為臨床試驗提供依據(jù)。

肝切片相較于其他體外培養(yǎng)技術(shù)主要有以下的優(yōu)點:(1)可以提供一個開放的研究藥物代謝的模型。

(2)避免了因細(xì)胞分離過程中蛋白酶對細(xì)胞造成的損害，維持了細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的聯(lián)系。

(3)保存一定的組織結(jié)構(gòu)，維持了肝腺泡功能和結(jié)構(gòu)的完整性。

(4)可以考察酶區(qū)域特異性表達(dá)和組織學(xué)改變。

(5)最為重要的一個特點是可以將同一個體的肝臟的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如肝微粒體的代謝和肝切片的代謝同時進(jìn)行比較。

2 精密肝切片的應(yīng)用

隨著技術(shù)水平的提高，肝切片已廣泛應(yīng)用于藥物研究，如探討藥物代謝途徑和產(chǎn)物、對藥物的毒性進(jìn)行評價和預(yù)測、研究藥物代謝種屬和年齡的差異和研究藥物對肝纖維化的作用機(jī)制等。

2.1 對藥物代謝的研究 肝臟具有豐富的代謝酶系，受試藥物經(jīng)過與肝切片共培養(yǎng)時，可以發(fā)生與體內(nèi)代謝相似的一相和二相反應(yīng)。通過檢測培養(yǎng)基和肝切片勻漿中代謝產(chǎn)物的變化，進(jìn)一步了解藥物在肝臟中的代謝過程。

藥物代謝的研究中的一個重要方面是分析藥物經(jīng)肝代謝所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。3-氟代麻黃堿 (3-fluoroethcathinone，3-FMC)是一個新開發(fā)的具有興奮中樞神經(jīng)作用的卡西酮類藥物。Pawlik等采用兔肝切片對該藥物的代謝進(jìn)行研究。3-FMC與兔肝切片共培養(yǎng)，在培養(yǎng)5、30、180 min時取培養(yǎng)基用LC/MS-TOF技術(shù)檢測其中代謝產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)3-fluorocathinone、 3-fluoromethcathinonediol、 3-fluoromethcathinoneimine和hydroxy-3-fluoromethcathinone四個主要的一相代謝反應(yīng)產(chǎn)物，為3-FMC的代謝研究打下基礎(chǔ)［6］。Laurent等發(fā)現(xiàn)乙醛的主要氧化產(chǎn)物4-羥基壬烯酸 (4-Hydroxy-2-nonenal，HNE)在體外肝切片經(jīng)ω-氧化，形成 4-hydroxynonenoic acid(HNA)、glutathione-HNE-conjugate(HNE-GSH)、glutathione-1，4-dihydroxynonene-conjugate(DHN-GSH) 和cysteine-HNE-conjugate(HNE-CYS)等4個主要代謝產(chǎn)物［7］。

藥物代謝研究的另外一個重要的方面則是研究藥物對肝藥酶的誘導(dǎo)效應(yīng)。Palamanda等對30種化合物在肝切片中對肝藥酶CYP1A1和CYP2B1的誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)行了研究。將化合物和肝切片共培養(yǎng)一段時間后，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測肝切片勻漿中相應(yīng)mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)30種化合物中僅有2種可以同時誘導(dǎo)CYP1A1和CYP2B1 mRNA的表達(dá)，該實驗結(jié)果與體內(nèi)試驗結(jié)果相類似［8］。結(jié)合免疫組化等技術(shù)，肝切片也為人們研究肝藥酶誘導(dǎo)和在肝臟不同區(qū)域特異性表達(dá)提供了f方法與技術(shù)，Martin等應(yīng)用人肝切片對苯巴比妥或環(huán)磷酰胺的肝藥酶誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明在藥物共孵育48 h后，肝切片中CYP2B6和CYP3A4的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)和酶活性都出現(xiàn)升高，發(fā)現(xiàn)有CYP2B6免疫反應(yīng)陽性的肝細(xì)胞可分布于整個肝切片上，而CYP3A4反應(yīng)陽性的肝細(xì)胞則主要分布于肝小葉的中央靜脈周圍［9］。

2.2 對藥物毒性的研究 由于肝切片保存了一定的組織機(jī)構(gòu)，維持了肝腺泡功能和結(jié)構(gòu)的完整性，在生化和生理功能上與在體肝相似，因而在評價藥物的毒性方面比其他的體外培養(yǎng)方法具有更大的優(yōu)勢。

蒼術(shù)苷是菊科植物蒼術(shù)Atractylodes lancea根莖中的一種糖苷型化合物，大劑量服用會導(dǎo)致一定的毒副作用，Obatomi等采用豬的肝或腎切片對蒼術(shù)苷的毒性和代謝進(jìn)行研究。將蒼術(shù)苷200、500、1.0、2.0 mmol/L與豬的肝切片和腎切片分別孵育3 h并檢測各項相關(guān)生化指標(biāo)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝切片培養(yǎng)基中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)未出現(xiàn)明顯變化，乳酸脫氫酶 (LDH)和丙二醛(MDA)升高、腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP)和谷胱甘肽(GSH)水平下降。并存在一定的劑量依賴。結(jié)果表明蒼術(shù)苷可引起一定的肝毒性［10］。

楊哲瓊等將 0.1、0.5、2.5 mmol/L濃度的氯化鎘(CdCl2)與肝切片共培養(yǎng)2 h后發(fā)現(xiàn)，在各劑量組均出現(xiàn)LDH漏出率增加、MTT還原量減少、一氧化氮 (NO)的分泌量增加，顯示肝細(xì)胞膜的完整性被破壞，抗氧化能力減弱，出現(xiàn)肝損傷。在2.5 mmol/L濃度的 CdCl2下與對照組相比，CYP水平和CYP3A4活性分別降低了47.6%、66.0%，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶-1(UDPGT-1)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶-2(UDPGT-2)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)分別比對照組下降了50.0%、35.6%、22.6%。表明CdCl2抑制肝臟的解毒功能從而使肝損傷更加嚴(yán)重［11］。回連強等將野百合堿0.02、0.1、0.5 g/L與肝切片共培養(yǎng)24 h后，與對照組相比LDH漏出率顯著上升，蛋白量顯著下降，提示野百合堿具有一定的肝毒性［12］。

張春等嘗試用肝切片技術(shù)進(jìn)行藥物對肝毒性保護(hù)作用的研究。當(dāng)50 mmol/L乙醇與肝切片共孵育發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中ALT、AST、LDH水平升高，顯示在該濃度下乙醇可導(dǎo)致一定的肝損傷;肝切片的組織勻漿檢測發(fā)現(xiàn)CYP2E1的標(biāo)志酶-苯胺羥化酶 (ANH)活性升高提示高濃度乙醇能顯著誘導(dǎo)CYP2E1活性。在將乙醇與463、694、1 388 nmol/L濃度的阿魏酸鈉共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，隨著阿魏素鈉濃度的升高培養(yǎng)基中ALT、AST、LDH濃度可明顯降低甚至回復(fù)到正常水平，并且ANH的活性也恢復(fù)正常。因此，在乙醇性肝損傷病理狀態(tài)下，阿魏素鈉不僅能提高損傷肝臟的抗氧化酶系活性，還能通過改變乙醇在肝臟的代謝途徑，使其由CYP2E1主導(dǎo)的毒性較大的病理性代謝途徑轉(zhuǎn)到毒性較小、更接近生理狀態(tài)下的代謝途徑，從而保護(hù)肝臟［13］。在對乙醇的主要毒性代謝產(chǎn)物—乙醛的毒性研究中，Guoyu等發(fā)現(xiàn)0.5、1、2 mmol/L濃度的阿魏素鈉可以有效的降低GST和丙二醛 (MDA)的濃度、抑制轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF-β1)的表達(dá)抑制從而抑制乙醛所致的肝毒性［14］。

2.3 研究動物種屬差異對藥物代謝及毒性的影響 此外肝臟是哺乳類動物主要的外源性物質(zhì)的代謝器官，也是最容易成為外源性物質(zhì)毒性的靶器官。不同種屬的動物對外源性物質(zhì)的代謝途徑也不盡相同，故同一藥物對不同種屬的動物可能造成不同的毒性反應(yīng)。

香豆素類藥物是一類口服抗凝藥，近年來發(fā)現(xiàn)其在不同的種屬的實驗動物體內(nèi)代謝途徑不一致。Steensma等對7-乙氧基香豆素和 ［3-14C］香豆素在小鼠、大鼠、豚鼠、食蟹猴和人的肝切片的代謝進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)7-乙氧基香豆素在上述五個種屬動物的肝切片都與D-葡萄糖酸和硫酸鹽共軛產(chǎn)生7-羥基香豆素。然而在小鼠和大鼠的肝切片上與硫酸鹽共軛結(jié)合的幾率遠(yuǎn)大于與D-葡萄糖酸結(jié)合。此外香豆素在以上五種動物的肝切片的代謝中也存在一定的異差。在食蟹猴和人的肝切片中香豆素主要與D-葡萄糖酸和硫酸鹽共軛產(chǎn)生7-羥基香豆素，小鼠的肝切片中主要產(chǎn)物是3-羥基化通路產(chǎn)物和未知產(chǎn)物，大鼠肝切片中主要是7-羥基香豆素、3羥基化通路產(chǎn)物和未知產(chǎn)物，而豚鼠中的主要產(chǎn)物為7-羥基香豆素和未知產(chǎn)物［15］。

將烯丙醇、甲基萘醌分別與大鼠、豚鼠、猴、人的肝切片共培養(yǎng)，并通過檢測蛋白質(zhì)合成總量、K+濃度、MTT實驗比較不同藥物對不同種屬動物的毒性表現(xiàn)。結(jié)果顯示烯丙醇和甲基萘醌對四種動物的肝切片都可以引起明顯的肝毒性，使蛋白質(zhì)合成減少、K+濃度降低、細(xì)胞壞死。但相較于與其它動物，大鼠對烯丙醇的敏感性要弱，在高濃度下才產(chǎn)生明顯的肝毒性［16］。Amin等將能夠?qū)е赂文憮p傷的藥物α-萘異硫氰酸 (ANIT)與大鼠或犬的肝切片共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在大鼠和犬肝切片的培養(yǎng)基中都可檢測到ALT、AST、ALP的水平顯著升高，但在大鼠肝切片中可出現(xiàn)比犬肝切片更明顯的炎癥因子和氧化指標(biāo)的變化［17］。

2.4 對肝纖維化的研究 肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，肝星狀細(xì)胞的激活是引起肝纖維化的主要因素［18］。

Guyot等將對乙酰氨基酚與肝切片共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過48 h后，出現(xiàn)圍繞小葉中央靜脈的肝細(xì)胞壞死，并且在這些區(qū)域血小板衍生因子β受體上升，提示了肝星狀細(xì)胞的活化。將N-乙酰半胱氨酸和對乙酰氨基酚共同加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)，未出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞的壞死和肝星狀細(xì)胞的活化［19］。Schaffert通過大鼠肝切片技術(shù)，將乙醇與肝切片共培養(yǎng)，結(jié)果顯示在24 h時細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降、脂質(zhì)過氧化水平升高、白介素-6呈持續(xù)的升高趨勢，在48 h出現(xiàn)平滑肌肌動蛋白 (SMA)和膠原蛋白1α明顯升高，提示纖維化反應(yīng)的加?。?0］。

吲哚-3-原醇是葡萄糖蔓芹苷的前體，大量存在于十字花科類食用蔬菜如西蘭花、卷心菜、甘藍(lán)花中。利用小鼠肝切片，武曉茜等研究了吲哚-3-原醇對乙醛活化肝星狀細(xì)胞的作用及其機(jī)制。研究中發(fā)現(xiàn)吲哚-3-原醇可不同程度的減少乙醛激活的肝星狀細(xì)胞，并可明顯降低乙醛升高的培養(yǎng)液中 GST、LDH活性和肝組織中 MDA和羥脯氨酸(Hyp)水平，并呈良好的濃度依賴性。吲哚-3-原醇給藥組與乙醛對照組比較，培養(yǎng)液中TGF-β1水平降低，MMP-1/TIMP蛋白表達(dá)比值升高。表明吲哚-3-原醇能有效拮抗乙醛所致的肝星狀細(xì)胞活化，其機(jī)制與降低細(xì)胞氧化應(yīng)激和促進(jìn)基質(zhì)膠原降解有關(guān)［21］。

3 展望

在肝切片技術(shù)出現(xiàn)的早期，該方法由于當(dāng)時技術(shù)的限制，并未得到廣泛的應(yīng)用。隨著目前儀器的發(fā)展與切片技術(shù)的提高，近年來才逐漸為人所重視，并在藥物代謝、毒理、肝纖維化等研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在國內(nèi)，該方法也逐漸被人們所熟知和應(yīng)用，據(jù)文獻(xiàn)報道，如張春、楊哲瓊等通過應(yīng)用肝切片的方法建立了相應(yīng)的體外肝損傷和肝纖維化模型，在對藥物毒理和肝纖維機(jī)制研究方面取得了較大進(jìn)展［11-12，14］。

但這項技術(shù)尚有以下幾個缺點需要解決和完善:(1)整個實驗的操作過程較為復(fù)雜。需要提供一個更為簡便、快速的制備肝切片的方法。(2)藥物不容易滲透到切片的內(nèi)部，有時難以像其他體外方法一樣評價藥物-藥物的相互作用。(3)需要建立明確的標(biāo)準(zhǔn)以提高肝切片的質(zhì)量。此外隨著目前各種檢測儀器的飛速發(fā)展，將肝切片與核磁共振、質(zhì)譜、基因芯片等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可以滿足未來以高通量、快速、精確為特點的藥物研究的需求［22-24］。相信隨著肝切片技術(shù)的發(fā)展和完善，該技術(shù)將會得到更多的關(guān)注和應(yīng)用。

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