個體化治療對結(jié)直腸癌病理診斷和分期的新要求

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

個體化治療對結(jié)直腸癌病理診斷和分期的新要求

盛偉琪

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

結(jié)直腸腫瘤；病理診斷；分期；個體化治療

近年來，由于生活方式的改變，例如高蛋白、脂肪，少谷物、蔬果的不合理膳食，身體活動程度減少，超重等因素的影響，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率、死亡率逐年上升，尤其在北京、上海、天津等大型發(fā)達城市。最近20年中，上海結(jié)直腸的發(fā)病率以每年約4.2%的速度遞增，據(jù)上海市疾病預(yù)防和控制中心2011年報告，2009年上海市惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在男性和女性中均居第二位，死亡率居男性第四、女性第二位［1］。雖然多學(xué)科綜合治療手段的應(yīng)用使得近60%的中晚期結(jié)直腸癌患者得到治愈，但仍然有40%～50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，成為患者死亡的主要原因［2］。影響結(jié)直腸癌生存、治療策略選擇、患者隨訪管理的最主要因素是腫瘤分期。然而，同一分期的患者預(yù)后也存在差異，分期也不能預(yù)測患者對輔助治療的有效性。因此，根據(jù)結(jié)直腸癌患者個體的具體情況選擇恰當?shù)闹委熓侄?，制定合適患者的個體化治療策略，成為當今結(jié)直腸癌診療的主要發(fā)展方向。個體化治療的發(fā)展，對病理診斷的模式也提出了新的要求，除了傳統(tǒng)的組織病理學(xué)診斷和病理分期外，病理診斷工作者還需要準確地評估手術(shù)切緣、尋找預(yù)后相關(guān)的組織學(xué)表現(xiàn)(如神經(jīng)、脈管侵犯)、檢測并評價與輔助治療療效相關(guān)的指標以及評價新輔助治療后的療效，并負責(zé)對這些檢查結(jié)果進行解釋。結(jié)直腸癌90%以上為源自結(jié)直腸黏膜上皮的腺癌［3］，本文就結(jié)直腸腺癌術(shù)后病理診斷規(guī)范和個體化治療相關(guān)病理檢測和評估進行介紹。

1 結(jié)直腸腺癌的常規(guī)病理診斷和分期

1.1 組織病理學(xué)分級和類型

傳統(tǒng)型結(jié)直腸腺癌主要表現(xiàn)為腺管的形成，腫瘤細胞形成腺管的比例是組織學(xué)分級判斷的指標，組織學(xué)分級是獨立于腫瘤分期的預(yù)后指標［4］。過去，組織學(xué)分級根據(jù)腺管形成的比例分為高分化(腺管形成＞95%)、中分化(腺管形成50%～95%)、低分化(腺管形成＜50%)和未分化四級，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2012年診斷根治性結(jié)直腸癌1 379例，其中68.3%為中分化腺癌。但這種分級往往受到病理醫(yī)生主觀因素的影響，重復(fù)性不佳。研究表明，以腺管形成比例50%作為界值，分為低級別(≥50%腺管形成)和高級別(＜50%腺管形成)腺癌，具有更高的可重復(fù)性以及和預(yù)后的相關(guān)性［5-6］。但基于腺管形成比例的組織學(xué)分級只適用于傳統(tǒng)型腺癌，不適用于特殊類型的結(jié)直腸腺癌。

在2010版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類中列出的特殊類型結(jié)直腸癌包括以下幾種：黏液腺癌、印戒細胞癌、髓樣癌、鋸齒狀腺癌、篩狀粉刺型腺癌、微乳頭狀癌、腺鱗癌、梭形細胞癌、未分化癌和其他少見類型癌，其中以黏液腺癌、印戒細胞癌相對常見。

黏液腺癌是指腫瘤50%以上的成分由細胞外黏液組成，黏液湖中腫瘤細胞呈腺泡狀、巢狀或印戒細胞樣單個排列。如果黏液成分不足50%，可以診斷為“含黏液腺癌成分”。在黏液湖中，上皮成分的成熟程度決定了腫瘤的分化程度，但是黏液腺癌的組織學(xué)分級取決于腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)類型。大多數(shù)黏液腺癌呈高水平MSI(high levels of MSI，MSI-H)，生物學(xué)行為較好，呈低級別腫瘤；而少部分微衛(wèi)星穩(wěn)定型(microsatellite stable，MSS)和低水平MSI(low levels of MSI，MSI-L)的黏液腺癌則侵襲性強，表現(xiàn)為高級別腺癌。

印戒細胞癌是指50%以上腫瘤細胞的細胞質(zhì)內(nèi)富含黏液、胞核偏位或貼邊的結(jié)直腸癌，往往呈彌漫浸潤性生長。如果印戒細胞癌比例不足50%，則診斷為“含印戒細胞癌成分”。結(jié)直腸印戒細胞癌不如胃常見，不足結(jié)直腸癌的1%［7］。同胃一樣，結(jié)直腸印戒細胞癌是高度侵襲性腫瘤，預(yù)后比傳統(tǒng)型腺癌差［7］。但部分印戒細胞癌具有MSI-H表型，生物學(xué)行為呈低級別［3］。

其他特殊類型腺癌比較少見，分別具有不同的分子表型，其中髓樣癌大多表現(xiàn)為MSI-H，盡管腫瘤細胞呈片狀排列，鮮有腺管形成，但預(yù)后較好［8］。

1.2 結(jié)直腸癌病理分期

盡管尚需完善，但首先由法國人Pierre Denoix提出，后經(jīng)美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)逐步建立，并于1968年正式出版第1版的《腫瘤TNM分期系統(tǒng)》。該系統(tǒng)目前仍是國際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)，是目前對于惡性腫瘤進行分期的標準方法，是目前最能預(yù)測預(yù)后、指導(dǎo)治療的腫瘤分期系統(tǒng)［9］。通過顯微鏡下檢查手術(shù)切除標本中腫瘤組織的浸潤深度(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠處轉(zhuǎn)移(M)狀況決定腫瘤分期。就結(jié)直腸腺癌T分期而言，T1(浸潤黏膜下層)、T2(浸潤固有肌層)和T3(穿透肌層浸潤漿膜下層或無腹膜覆蓋的結(jié)直腸旁組織)相對比較容易判斷，但是對于T4的理解可能存在偏差或不確定。當手術(shù)標本取材不當、不完整時，可能遺漏“漿膜侵犯”；當腫瘤所在部位沒有臟層腹膜覆蓋時，“漿膜面”和由手術(shù)切除形成的平整或不平整的“環(huán)切緣”難以區(qū)別，T3的腫瘤可能因手術(shù)不當造成環(huán)切緣陽性而誤認為T4a(漿膜面浸潤)，而T4的腫瘤環(huán)切緣陰性誤判為T3。其次，當腫瘤與鄰近器官或組織粘連伴有炎癥，甚至形成膿腫或纖維化時，局部結(jié)構(gòu)不清可能誤診為T4b。另外，對于“臟層腹膜侵犯”的判斷，病理醫(yī)生之間可能存在意見不一致，尤其當腫瘤細胞鄰近漿膜而后者伴有炎癥或增生時，不一致性更加顯著。因此，美國病理醫(yī)師協(xié)會(College of American Pathologists，CAP)只將以下兩種情況列為“漿膜侵犯”，一為腫瘤細胞出現(xiàn)在漿膜面伴炎癥反應(yīng)、間皮增生和(或)糜爛，二是漿膜面出現(xiàn)游離腫瘤細胞伴下方臟層腹膜潰瘍時［10］。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷對大多數(shù)病理醫(yī)生來說并非難事，但對于在腸壁旁纖維脂肪組織中出現(xiàn)的和腫塊不延續(xù)的腫瘤細胞團，且沒有殘留淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)時，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌結(jié)節(jié)的區(qū)分意見不一。第5版TNM分期規(guī)定3 mm大小以上的結(jié)節(jié)記為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3 mm以下則劃歸非連續(xù)性浸潤(T3)。第6版則無論大小，將邊緣平整、圓形的結(jié)節(jié)都記為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，將形狀不規(guī)則的結(jié)節(jié)劃歸T分期或靜脈侵犯。研究表明，無論非連續(xù)性浸潤、靜脈侵犯伴血管外播散還是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后完全性結(jié)構(gòu)消失都能形成“腫瘤種植”(tumor deposit)，均導(dǎo)致無病生存和總生存時間的減少，與預(yù)后相關(guān)［11-12］。因此，現(xiàn)行的第7版TNM分期規(guī)定，當無區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，無論形狀、大小，將出現(xiàn)腫瘤種植歸為N1c，提示需要進行術(shù)后輔助治療，腫瘤種植不影響T分期［9］。

2 高危因素的評估

腫瘤分期是影響結(jié)直腸癌患者生存的最主要因素，也是目前臨床輔助治療應(yīng)用的主要判斷依據(jù)。但是同一分期的不同患者預(yù)后存在差異，分期也不能預(yù)測輔助治療的療效，由于輔助化療存在不良反應(yīng)，治療費用高也會對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此需要分析除了分期以外影響預(yù)后的因素和預(yù)測化療獲益的指標，篩選需要進一步治療并能從中獲益的結(jié)直腸癌患者，予以輔助治療，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高療效。

2.1 環(huán)切緣(circumferential resection margin，CRM)

CRM是指結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本上沒有腹膜覆蓋的表面。根據(jù)解剖學(xué)特點，除了部分上段直腸外，整個中下段直腸表面均為CRM。CRM是評價直腸癌手術(shù)質(zhì)量、與直腸癌局部復(fù)發(fā)相關(guān)的重要指標，對新輔助治療后手術(shù)切除標本進行CRM評估作為預(yù)后指標的價值更大。第7版TNM分期對直腸癌全系膜切除標本CRM陰性的定義為“距離腫瘤邊緣＞1 mm”。Bernstein等［13］隨訪了3 196例直腸癌根治術(shù)后患者，發(fā)現(xiàn)CRM在0～2 mm之間的患者5年復(fù)發(fā)率為23.7%，5年遠處轉(zhuǎn)移率為43.9%，5年生存率為44.5%，而CRM＞2 mm的患者相應(yīng)5年復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和生存率分別為8.9%、21.7%和66.7%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，CRM陽性的患者需要接受術(shù)后局部放療。

CRM受累的模式多種，包括腫瘤連續(xù)性直接浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤種植和脈管侵犯等。大體檢查手術(shù)標本時，需要仔細觀察腫瘤所在部位的表面是否完整、光滑，若有表現(xiàn)為蟲蝕狀、固有肌層暴露等CRM受累高度可疑病例，必須多取材制片，顯微鏡下觀察確定切緣性質(zhì)。

2.2 神經(jīng)周侵犯(perineural invasion，PNI)

作為惡性腫瘤較為常見的組織病理學(xué)表現(xiàn)，PNI在頭頸部、前列腺、胰腺腫瘤中的預(yù)后價值已經(jīng)被廣泛接受，也是異質(zhì)性較大的Ⅱ期結(jié)直腸癌公認的高危因素之一。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院對173例直腸癌根治術(shù)病例回顧性研究發(fā)現(xiàn)，PNI陽性患者5年局部復(fù)發(fā)率是陰性組織的2.9倍［14］，PNI陽性也是直腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)的重要因素。過去認為，只有腫瘤細胞浸潤至神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜或神經(jīng)內(nèi)膜的任意一層才能診斷神經(jīng)侵犯，但Liebig等［15］研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)周侵犯具有相同的意義，PNI陽性和陰性患者5年無病生存率和總生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，前者PNI陰性的患者5年總生存率達72%，而陽性患者只有25%。廣義的PNI陽性有兩種表現(xiàn)：腫瘤細胞圍繞神經(jīng)周圍至少1/3周，未浸潤至神經(jīng)內(nèi)；或腫瘤細胞浸潤至神經(jīng)外膜、束膜和內(nèi)膜任意一層。過去由于對PNI的認識不足，實際工作中不予重視，漏診率很高，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院回顧性分析發(fā)現(xiàn)漏診率高達69%［14］，可能和過去PNI定義不統(tǒng)一，某些特殊類型腫瘤出現(xiàn)較多炎癥細胞和大片黏液湖，腫瘤細胞浸潤神經(jīng)組織不易被辨認有關(guān)。

2.3 淋巴結(jié)檢出數(shù)目

在TNM分期中，雖然N分期取決于轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)量，但是淋巴結(jié)檢出總數(shù)同樣具有重要意義。Le Voyer等［16］分析了3 411例結(jié)直腸癌病例，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)受累數(shù)目和總生存期相關(guān)，當受累淋巴結(jié)數(shù)量相同時，淋巴結(jié)檢出數(shù)目越多，生存時間越長；即使沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，檢出淋巴結(jié)數(shù)量越多，總生存越好。AJCC和CAP都建議結(jié)直腸癌手術(shù)標本淋巴結(jié)檢出數(shù)目至少達到12個，尤其對于II期結(jié)直腸癌患者，淋巴結(jié)檢出數(shù)目不足12枚是N0病例的高危因素［9-10］。大多數(shù)病理醫(yī)生都能根據(jù)規(guī)范找到至少12枚淋巴結(jié)進行評估，當淋巴結(jié)檢出數(shù)不足12枚時，可以通過一些輔助方法提高檢出率，例如注射美蘭［17］。需要指出的是淋巴結(jié)檢出數(shù)量不僅僅與檢查的病理醫(yī)生相關(guān)，也和患者個體差異、標本長度、腸壁旁纖維脂肪組織的厚度、腫瘤大小等有關(guān)。經(jīng)新輔助放化療的手術(shù)標本的淋巴結(jié)數(shù)目可能顯著較少，建議病理醫(yī)生在仔細尋找后淋巴結(jié)數(shù)目仍達不到12枚時，應(yīng)在病理報告中予以說明。

3 免疫組織化學(xué)和分子病理檢測

3.1 免疫表型

角蛋白(cytokeratin，CK)7、20和腸道特異性尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(caudal related homeodomain transcription 2，CDX2)是常用的結(jié)直腸腺癌免疫標志物，絕大多數(shù)結(jié)直腸癌表現(xiàn)為CK7-，CK20+，CDX2+，但約20%的結(jié)直腸腺癌呈CK7+/CK20-或CK7-/CK20表型。研究提示，CK20表達的減弱和缺失往往和MSI-H相關(guān)［18］。逾90%結(jié)直腸腺癌CDX2呈陽性表達，但是任何伴有腸分化的上皮性腫瘤都可以表達CDX2，因此CDX2并不是結(jié)直腸癌特異性標志物［19］。一些特殊類型的結(jié)直腸腺癌，免疫表型不同于傳統(tǒng)型腺癌，比如髓樣癌往往不表達CK20和CDX2，CK20表達的缺失與腫瘤MSI-H表型相一致［18］。

3.2 MSI和錯配修復(fù)蛋白的檢測

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段、多基因參與的過程，除了25%具有獨特的分子遺傳學(xué)改變的遺傳性結(jié)直腸癌外，其余75%的散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生機制較為復(fù)雜，目前至少有兩種導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的基因途徑得到廣泛認可，第一是染色體不穩(wěn)定性(chromosomal instability，CIN)以及癌基因和抑癌基因的變異，主要由APC、K-ras以及p53基因參與［20］；第二是DNA錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)功能缺失導(dǎo)致的廣泛MSI［21］。約10%～15%散發(fā)性結(jié)直腸癌表現(xiàn)為MSI，并具有獨特的臨床病理特點，包括右半結(jié)腸癌、腫塊較大、腺管形成少等，與MMS型結(jié)直腸癌相比，MSI結(jié)直腸癌一般預(yù)后較好，但對氟尿嘧啶(5-FU)類化療藥物不敏感［22］。

微衛(wèi)星序列是重復(fù)單位1～6個核苷酸的DNA簡單重復(fù)序列，廣泛分布于染色體基因組。正常情況下，微衛(wèi)星DNA在人群中表現(xiàn)高度的個體特異性，并且突變率極低，穩(wěn)定性高。DNA錯配修復(fù)基因保證了DNA的高保真復(fù)制，若DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)存在缺陷，DNA復(fù)制過程中，DNA多聚酶鏈滑現(xiàn)象得不到及時修正，便會出現(xiàn)微衛(wèi)星序列重復(fù)次數(shù)的增多或減少，這種現(xiàn)象被稱為MSI。MSI是DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)異常的表現(xiàn)。1997年遺傳性費息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)國際合作小組統(tǒng)一了基于PCR的MSI檢測位點(Bethesda panel)，即2個單核苷酸重復(fù)序列BAT25、BAT26和3個雙核苷酸重復(fù)序列D2S123、D5S346、D17S250，并對MSI進行了定義：比較腫瘤和相匹配的正常組織DNA，5個位點中至少2個位點有重復(fù)序列長度變化者為MSI-H，只有 1個位點有長度變化者為MSI-L，無任何位點變化的為MSS。MSI-L的臨床意義存在爭議［23］。

由于MSI檢測對組織的要求較高，通常要選擇含70%以上腫瘤細胞的組織提取DNA進行檢測，需要正常組織對照，檢測所需時間較長、費用較高。研究證實MSI與MMR功能改變呈正相關(guān)，MSI和MMR蛋白缺失是MMR基因發(fā)生異常的兩種表現(xiàn)型，通過MSI檢測可以反映MMR基因突變，亦可以檢測MMR蛋白表達的改變來反映MMR基因的改變，從而反映MSI的狀態(tài)。運用免疫組織化學(xué)方法聯(lián)合檢測4種MMR蛋白：MLH1、MSH2、PMS2及MSH6的表達可以間接反映MSI狀態(tài)，也可以作為Ⅱ期結(jié)直腸癌運用5-FU類化療藥物的療效評估［22，24］。這4種蛋白廣泛存在于正常細胞，但在MSI腫瘤細胞中表達缺失，不同的表達模式可以間接反映潛在的遺傳或表觀遺傳學(xué)異常。

3.3 K-ras和BRAF基因突變的檢測

隨著表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗在結(jié)直腸腺癌治療中的應(yīng)用，結(jié)直腸腺癌治療步入了靶向治療時代，然而西妥昔單抗治療的效果受其下游基因K-ras狀態(tài)的影響［25］。K-ras是EGFR通路下游的重要癌基因，在細胞生長和血管生成等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要的調(diào)控作用。當K-ras基因發(fā)生突變，可以不依賴于上游的EGFR發(fā)生自身磷酸化而處于持續(xù)激活狀態(tài)，因此突變型K-ras基因的結(jié)直腸癌患者使用抗EGFR藥物治療無效［25-26］。此外，EGFR信號通路中其他下游基因，包括BRAF也可以影響抗EGFR靶向治療的療效［27］。因此，K-ras、BRAF等基因突變的檢測分析對結(jié)直腸腺癌治療方案的選擇，尤其是抗EGFR靶向藥物治療的選擇具有重要意義。K-ras突變檢測已納入中國版《國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》2011版。

結(jié)直腸腺癌K-ras突變率為30%～40%［28］，已報道的點突變多大3000個，最常見的是2號外顯子第12和13位密碼子(85%～95%)，其他位點包括3號外顯子的第61和146位密碼子，約5%。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科檢測557例結(jié)直腸腺癌中K-ras基因2號外顯子突變，突變率為40.4%，常見位點為也是第12和13位密碼子，突變率分別為32.0%和8.3%［29］。國外研究報道，結(jié)直腸腺癌中BRAF基因突變率8%～15%［28］，中國臺灣地區(qū)僅為3.8%［30］，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科檢測197例結(jié)直腸腺癌患者BRAF突變率為5.1%［28］，與中國香港地區(qū)報道一致，提示中國結(jié)直腸癌患者經(jīng)BRAF突變途徑的發(fā)生率較低，突變熱點同樣位于第600位密碼子(V600E)［30］。

除了與抗EGFG靶向治療療效預(yù)測相關(guān)外，BRAF基因突變幾乎只發(fā)生于通過鋸齒狀途徑發(fā)生的散發(fā)型MSI結(jié)直腸腺癌，從未有出現(xiàn)于Lynch綜合征的報道，在70%～90%的MSI型散發(fā)型結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，突變的被激活的BRAF基因和DNA甲基化以及MLH1基因表觀遺傳沉默高度相關(guān)［31］，因此在MSI腫瘤中檢測BRAF突變將有助于闡明腫瘤發(fā)生的機制。另外，BRAF突變對MSI型及直腸癌的預(yù)后判斷也有意義，野生型BRAF MSI-H腫瘤預(yù)后最好，BRAF突變的MSS腫瘤預(yù)后最差，野生型BRAF MSS腫瘤預(yù)后介于兩者之間［32］。

4 小結(jié)

結(jié)直腸癌是一種具有明顯異質(zhì)性的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率在我國逐年上升，分子靶向藥物的運用和個體化治療的快速發(fā)展，需要病理醫(yī)生在原有傳統(tǒng)病理檢查和診斷的基礎(chǔ)上為臨床療效預(yù)測、患者治療策略選擇和預(yù)后管理方案制定提供更加完整、全面的信息，免疫組織化學(xué)和分子病理學(xué)技術(shù)在現(xiàn)代病理診斷中的廣泛應(yīng)用為滿足現(xiàn)代病理診斷提供了技術(shù)平臺，病理醫(yī)生應(yīng)當及時更新知識，加強與臨床醫(yī)生的溝通，積極參與多學(xué)科綜合治療討論，符合個體化治療時代對病理醫(yī)生和診斷的新要求。

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