子宮內(nèi)膜異位癥動物模型研究進展

崔陽陽，孫偉偉，趙瑞華

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院婦科，北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)，簡稱內(nèi)異癥，是生育年齡婦女的常見病，發(fā)病率高達10% ～15%，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。由于倫理道德的因素，無法對患病婦女反復進行創(chuàng)傷性檢查或進行侵襲性對照性試驗研究。因此，動物模型成為研究該疾病重要手段。目前，國內(nèi)外已建立家兔、鼠類和靈長類等多種動物模型，為進一步研究建立更適用的動物模型，本文現(xiàn)從實驗動物選擇、傳統(tǒng)動物模型、新型特殊動物模型的構建方法及優(yōu)缺點角度，對子宮內(nèi)膜異位癥動物模型研究的新進展進行綜述。

1 實驗動物選擇

1.1 鼠類

鼠類為現(xiàn)階段國內(nèi)子宮內(nèi)膜異位癥相關研究最為常用的動物模型。鼠類動情周期短而規(guī)律，性成熟早，繁殖力強，可自發(fā)排卵，但不發(fā)生子宮內(nèi)膜脫落，故只可用于建立誘發(fā)性EMs 模型。

由于SD 大鼠對性激素敏感，適應性和抗病能力強，更有利于移植的內(nèi)膜的成活及生長，從而建模成功率高于Wistar 大鼠。有學者認為，大鼠的子宮內(nèi)膜有著與人類相似的不同分泌時期［1］，可為子宮內(nèi)膜異位癥研究提供良好模型。但Cumming 等［2］認為，小鼠在某些方面可能優(yōu)于大鼠模型。國內(nèi)外現(xiàn)已成功建立人子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型［3，4］。SCID 小鼠建模成功率為96.5% ～100%，高于裸鼠，病灶可存活長達10 周［5，6］。NOD/SCID 小鼠較SCID 小鼠更易于接受人類內(nèi)膜組織的移植，因此更近似于人類子宮內(nèi)膜異位癥的形成條件。

鼠類EMs 模型可用于研究子宮內(nèi)膜異位癥對妊娠、排卵、粘連形成、黃體功能缺陷及自身免疫(除免疫缺陷小鼠)等方面的影響，也可用于研究藥物或其他因素對子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制。免疫缺陷小鼠EMs 模型保留了人類子宮內(nèi)膜組織原有的生物特性，對于研究早期EMs 發(fā)病機理，藥物治療方面有重要意義，并且對各種藥物的敏感性不發(fā)生改變。但是，免疫缺陷小鼠本身的生理特性，使得其應用存在一定局限性。

1.2 靈長類動物

獼猴與狒狒都屬于靈長類動物，成年雌性有正常月經(jīng)周期，遺傳背景、內(nèi)分泌、月經(jīng)周期和解剖結構等多種生物學特性，以及自發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的發(fā)展過程及病灶形態(tài)學方面與人類極為相似。國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，獼猴的個體差異及家族聚集性，在一定程度上影響著建模的成功率［7，8］。目前，國外學者認為狒狒是最理想的子宮內(nèi)膜異位癥模型，它比獼猴耐受性更強，可體外觀察月經(jīng)周期［9］。狨猴是特殊的無月經(jīng)周期的非人類靈長類動物，其基因與人類基因相似度為97.5%，其高水平的外周雌激素特點為研究內(nèi)異癥的發(fā)病機理、藥物治療以及局部與中樞的雌激素代謝作用關系方面提供了新模型［10］。Einspanier 等［11］實驗中72%的狨猴在2 ～3年內(nèi)誘發(fā)子宮內(nèi)膜異位，目前國內(nèi)尚無此模型的構建。但是，靈長類動物的價格昂貴，自發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥成模率低，物種稀有，實驗周期長，飼養(yǎng)條件高，個體差異影響造模成功率。因此，靈長類動物模型的使用受到限制。

1.3 其他動物

雌性家兔周期規(guī)律，屬于刺激性排卵型動物，此模型可用于排卵、拾卵、卵子運輸方面的研究。家兔對生存環(huán)境要求高，易感染，耐受性低，相對而言，鼠類模型在某些方面優(yōu)于家兔模型［12］。

巴馬香豬，其基因組與人類有明顯的同源性，是器官移植和疾病模型的理想材料。最近國內(nèi)已成功構建了巴馬香豬EMs 模型［13］，但該模型應用較少。

雞胚尿囊膜的EMs 模型，是將包含腺體和間質(zhì)的人子宮內(nèi)膜碎片種植到孵化7 ～10 d 的受精雞胚尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)的基底層。該模型很適合研究內(nèi)異病灶形成早期的侵襲和血管生成機制，但與人類內(nèi)異癥的形成機制、外周環(huán)境差異較大，使用范圍受限。

2 傳統(tǒng)動物模型

2.1 自發(fā)性和誘發(fā)性模型

動物模型按照EMs 產(chǎn)生的病因分為兩類，一類是自發(fā)性動物模型，此類模型僅發(fā)生于靈長類動物。另一類是誘發(fā)性動物模型，即根據(jù)Sampson 的經(jīng)血逆流種植學說，通過各種外科手術法或內(nèi)膜碎片注射法將內(nèi)膜組織或細胞移植于動物子宮腔以外的部位，或是通過手術閉鎖其子宮頸或陰道口，人為造成經(jīng)血逆流入腹腔，形成EMs 病灶，從而誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。誘發(fā)性動物模型又分為異體移植和自體移植。

2.2 自體移植和異體移植

2.2.1 自體移植

自體移植是通過手術方法，直接將自體子宮內(nèi)膜種植到子宮腔以外的部位或通過手術閉鎖其子宮頸或陰道口，造成經(jīng)血逆流入腹腔而誘發(fā)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生［14］。自體移植可用于免疫學方面及藥物治療方面的研究，但動物和人的內(nèi)膜存在生化特征等方面的差異，自體移植動物的組織學特性與生物反應不完全適用于人類，因此，從實驗結果到臨床實踐過程中，仍需更多的研究與實驗加以證明。

2.2.2 異體移植

異體移植是據(jù)移植物的性質(zhì)可分為同種異體移植和異種異體移植。同種異體移植即為同系小鼠或大鼠進行異體移植，而異種異體移植則是將人子宮內(nèi)膜組織種植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。這種方法可保留人類內(nèi)膜組織的生物學特征，可以用來研究人類子宮內(nèi)膜固有的侵襲能力及藥物療效，副反應等方面的研究，但由于免疫缺陷小鼠的使用，雖避免了排斥反應，但在不同程度上影響了腹腔液中的生長因子及細胞因子。

3 新型特殊EMs 動物模型

3.1 熒光EMs 模型

目前，熒光EMs 動物模型在子宮內(nèi)膜異位癥的基礎研究方面應用日益廣泛。EMs 動物模型的光學成像技術主要采用熒光染料法和熒光素酶生物發(fā)光，如熒光染料標記內(nèi)膜、基因轉(zhuǎn)染以及熒光轉(zhuǎn)基因動物在體內(nèi)膜［16］。劉斌等［17］研究發(fā)現(xiàn)，應用AdeGFP 轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞混懸液注射建立活體熒光觀察模型，與直接轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜相比，成模率高且體外熒光存在時間較長。

熒光活體無創(chuàng)觀察模型為動態(tài)活體研究提供良好EMs 模型，其特點包括:①定位準確，但病灶的定量種植及觀察缺乏客觀的標準。②熒光表達時間最長為4 周，僅限于EMs 早期相關研究。③靈敏度高，特異性好，適用于異位病灶的探測觀察與研究，但不利于盆腹腔深部病灶觀察。

3.2 基因突變模型

Dinulescu 等［29］建立K-ras 基因突變模型，是自發(fā)形成EMs 的小鼠模型。小鼠卵巢表面上皮致癌基因K-ras 激活導致卵巢EMs 樣病灶，47%小鼠發(fā)生腹膜EMs 樣病灶，潛伏期長約8 個月，外顯率約為50%。由于無K-ras 基因突變在人EMs 發(fā)生，因此該模型不能代表人EMs 的基因型，僅可研究其組織形態(tài)、生物學及治療。

3.3 人免疫功能重建鼠EMs 模型

由于傳統(tǒng)的人子宮內(nèi)膜異位癥動物模型使用免疫缺陷小鼠無法進行免疫學方面的研究，因此，王群華等［18］率先采用早孕人蛻膜與其臍血單個核細胞聯(lián)合移植，建立人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。此模型使NOD-SCID 小鼠具有人的免疫功能，移植后的組織仍保持子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)，性狀顯著穩(wěn)定，為免疫學變化、發(fā)病機理方面的研究提供良好模型，具有重要的臨床參考意義。

3.4 復發(fā)型子宮內(nèi)膜異位癥模型

子宮內(nèi)膜異位癥術后復發(fā)率達6.1% ～40.0%［19］。目前，我們對EMs 復發(fā)的機制尚不明確，需要借助動物模型進行研究。黃潔明等［20］采取成模后手術切除法建立復發(fā)型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型。同時，楊艷環(huán)等［21］驗證了具有子宮內(nèi)膜異位癥復發(fā)風險大鼠模型的可行性。

3.5 體外細胞模型與細胞腹腔注射

體外分離和培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細胞比子宮內(nèi)膜異位動物模型更接近于人體的特點，不僅可以觀察子宮內(nèi)膜細胞增長、侵襲、轉(zhuǎn)移等情況，而且還可以進行細胞化學、超微結構、塵物學特性和分子生物學方面的研究。國內(nèi)外學者［22，23］證明，更推薦選用人在位子宮內(nèi)膜作為EMs 模型的標本來源。為彌補體外細胞模型對EMs 的研究缺乏對整體環(huán)境的考慮的缺陷，Beliard 等［24］內(nèi)膜細胞的腹腔注射實驗結果表明，移植內(nèi)膜的完整結構是造模成功的前提條件，而雌激素在病灶生長中起到了一定的促進作用。

3.6 中醫(yī)病證結合動物模型

目前，國內(nèi)建立了具有中醫(yī)特色的子宮內(nèi)膜異位癥動物模型，主要從肝郁型和腎虛血瘀型兩方面進行探索。肖純等［25］通過手術移植法加腎上腺素皮下注射法，建立肝郁型EMs 模型。楊心弦等［26］以手術移植法建立血瘀型EMs 大鼠模型。冉青珍等［27］從“墮胎傷腎”“產(chǎn)褥期勞倦”“產(chǎn)褥期受寒”“產(chǎn)褥期氣滯”四個方面成功建立腎虛血瘀型EMs模型。但是，臨床上中醫(yī)證型會隨時間推移呈現(xiàn)復雜的證型演變，但此類模型病因模擬單一，無法與臨床病證變化完全一致。

4 模型構建方法

4.1 內(nèi)膜取材

子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的內(nèi)膜取材包括正常婦女子宮內(nèi)膜，內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜，早孕人蛻膜，人子宮內(nèi)膜細胞，以及動物的內(nèi)膜與動物子宮組織。王群華等［28，29］實驗證明，在位內(nèi)膜和早孕人蛻膜建模成功率皆為93.75%，動物子宮內(nèi)膜的剝離，分為剝離法﹑刮取法﹑擠壓法剪碎法［30］。大鼠一般采用剝離法;由于小鼠可以采取刮取法﹑擠壓法及剪碎法，其中擠壓法是獲取小鼠子宮內(nèi)膜理想的方法，而剪碎法操作簡化且還可以分析異位病灶中肌層的變化，有利于對內(nèi)異癥發(fā)病機制的全面探討，但子宮組織塊移植較內(nèi)膜移植更易發(fā)生粘連。

4.2 內(nèi)膜移植方法

內(nèi)膜移植方式包括:腹腔手術縫合法，皮下手術縫合法，腹腔放置法，腹腔注射法和皮下注射法。

手術移植方法［31］種植的部位定位準確，便于觀測病灶，但手術操作以及異物刺激可能影響盆腔微環(huán)境，對模型的建立存在一定影響，也易造成動物的腹腔粘連、感染和動物死亡;盆腔廣泛粘連也是EMs的病理特點之一，這一病理特點無法單純的炎性反應解釋，仍需要進一步研究。相比之下，注射法［32］對動物的創(chuàng)傷小，不易感染，病灶生長部位分散且易見粘連帶，符合人類內(nèi)異癥的發(fā)病特征，但這也為病灶的觀測及取材帶來一定困難。

腹腔種植雖為病灶的生長創(chuàng)造了與人類發(fā)病相似的腹腔環(huán)境條件，但多次開腹探查在一定程度上干預著病灶形成，并導致動物生命活力下降。皮下種植可連續(xù)直觀的觀察病灶的生長變化，便于操作和測量。因此，采用皮下和腹腔兩種部位同時種植，更能反映病變的過程。

4.3 模型建立結果

4.3.1 病灶生長形態(tài)

病灶的顏色，盆腔粘連帶的形成隨著造模后的時間變化而不同，異位病灶一般在4 ～6 天開始出現(xiàn)，可持續(xù)8 ～10 周，肉眼可見移植物增大，可呈隆起的小包狀的透明結節(jié)或囊腫，囊內(nèi)充滿黃色或透亮漿液，移植物被結締組織覆蓋并有血管生成，病理切片可見移植物中包含有子宮內(nèi)膜上皮細胞，腺體和間質(zhì)的生長，并有分泌活動。

4.3.2 病灶生長部位

子宮內(nèi)膜異位病灶生長范圍極為廣泛，主要受到移植內(nèi)膜方法的影響，同時也受周圍生長環(huán)境［33，34］的影響;另外，病灶的生長也可能與動物行走及活動方式的姿勢不同而出現(xiàn)差異。

5 小結

由于子宮內(nèi)膜異位癥特殊的病理、生理特點及倫理道德因素，在未來較長時間內(nèi)，動物模型都將是研究該疾病重要手段。雖然現(xiàn)在有多種建模方法，但都有各自的不足之處，而動物模型應用也存在一定局限性。理想的動物模型應該盡可能與人類疾病相似，模型構建標準化、規(guī)范化，能夠準確的反映疾病的發(fā)生、發(fā)展、變化。另外，人類子宮內(nèi)膜異位癥按R-AFS 修正分期進行分期，在多種內(nèi)異癥動物模型中，就子宮內(nèi)膜異位癥動物模型嚴重程度分級而言，目前還未有研究涉及EMs 動物模型嚴重程度分級。動物模型需要進行嚴格評估，使之成為所研究的疾病的代言，更好的指導臨床實踐。

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