三種突變GRK4 轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓動(dòng)態(tài)分析

鮑丹，董偉，劉寧，張旭，呂丹，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

高血壓是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管病之一，目前全球高血壓患者約有10 億，如不采取積極有效的預(yù)防措施，預(yù)計(jì)到2025 年，全球的高血壓患者可能會(huì)再增加80%［1］。因此，高血壓的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多巴胺是由交感神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的主要的兒茶酚胺類物質(zhì)之一，當(dāng)腎臟鈉濃度升高時(shí)，局部產(chǎn)生的多巴胺通過與腎近曲小管上的D1和D2樣受體結(jié)合，抑制鈉的重吸收，促進(jìn)尿鈉排泄，調(diào)節(jié)血壓。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性高血壓大鼠和人類原發(fā)性高血壓患者腎臟多巴胺功能均受損［2－5］，原因是多巴胺D1受體(dopamine D1receptor，D1R)功能減弱，其活性受G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G－protein－coupled receptor kinases，GRKs)調(diào)控。G 蛋白偶聯(lián)受體激酶4(G－protein－coupled receptor kinase 4，GRK4)是GRKs 家族成員，編碼GRK4 的基因定位4p16.3，該位點(diǎn)已被證實(shí)與高血壓的發(fā)生相關(guān)［6］。在正常情況下，GRK4 主要在睪丸和子宮肌層中表達(dá)，腦和腎臟組織中表達(dá)低［7－9］;而在自發(fā)性高血壓大鼠和人類原發(fā)性高血壓患者腎臟中GRK4 表達(dá)增高［9］，活性增高的GRK4 一方面可導(dǎo)致腎臟D1R 功能受損，另一方面可增強(qiáng)血管緊張素1 型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)的功能，從而導(dǎo)致腎臟尿鈉排泄障礙，血壓升高。

已有報(bào)道，GRK4 的突變與腎臟促尿鈉排泄功能受損和高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，其中R65L(rs2960306 )、A142V(rs1024323 )和 A486V(rs1801058)是現(xiàn)階段研究頻率較高的三個(gè)突變。研究發(fā)現(xiàn)，GRK4 基因突變的發(fā)生頻率具有種族特異性，如GRK4γR65L和GRK4γA142V在加納人和黑種人中的發(fā)生率較高，而GRK4γA486V在中國人、日本人和白種人中的發(fā)生率較高［10－11］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在意大利人群中GRK4γA486V同高血壓顯著相關(guān)(P =0.034)［12］。在另一個(gè)在澳大利亞人群中的研究也發(fā)現(xiàn)GRK4γA486V同高血壓密切相關(guān)(P =0.02)，并且還發(fā)現(xiàn)GRK4γR65L和GRK4γA142V與男性舒張壓呈正相關(guān)(P =0.009，P =0.002)［13］。在對(duì)中國北方漢族人群的研究中發(fā)現(xiàn)，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同時(shí)存在可使高血壓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較無突變?nèi)巳焊? 倍［14］。在日本人群中，若GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V三個(gè)突變同時(shí)存在，其對(duì)鹽敏感性高血壓發(fā)生的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)94%［11］。

基于上述現(xiàn)狀，本研究通過建立GRK4γ 野生型和三種GRK4γ 基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠，并對(duì)其血壓進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。擬為研究GRK4γ 突變與高血壓發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供有價(jià)值的疾病動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J 小鼠和ICR 小鼠購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2012－0001］。GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠由本實(shí)驗(yàn)室制作［SCXK(京)2013－0002］。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均在無特定病原體(specific－pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間［SYXK(京)2009－0003］飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ILAS－GC－2012－001)。

1.1.2 主要試劑及儀器

突變?cè)噭┖匈徸悦绹鳶tratagene 公司。限制性內(nèi)切酶如Nhe I、Xba I 和Pvu I 以及PCR 相關(guān)試劑均購自中國寶生物工程有限公司。PCR 引物由中國上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。NC 膜購自美國Millipore 公司。鼠抗GRK4 抗體購自德國Abnova 公司。HRP－偶聯(lián)的羊抗鼠抗體和HRP－偶聯(lián)的GAPDH 單克隆抗體分別購自美國Santa Cruz 公司和中國康成生物公司。BP－98A 智能無創(chuàng)血壓計(jì)購自日本SoftronTM公司。

1.2 方法

1.2.1 GRK4γwt/R65L/A142V/A486V表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

以pCMV6－XL－h(huán)－GRK4 質(zhì)粒(OriGene，美國，Clone ID NM_001004056.1)為模板，用PCR 法擴(kuò)增人GRK4 全長cDNA，以此為模板，以突變?cè)噭┖袠?biāo)準(zhǔn)操作程序分別將65 位精氨酸(R)突變?yōu)榱涟彼?L)、142 位丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)和486 位丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)，即獲得突變體GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V，經(jīng)測(cè)序并比對(duì)正確后，PCR 擴(kuò)增獲得帶有Nhe I 和Xba I 酶切位點(diǎn)的完整人源 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因，將擴(kuò)增片段插入pMD18T 載體，經(jīng)測(cè)序并比對(duì)正確后，以Nhe I 和Xba I 酶切回收 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V片段，并分別克隆入雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下游構(gòu)建全身表達(dá)人GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V表達(dá)載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，再用Pvu I 將其線性化，Sephedex G50 柱純化DNA 片段，獲得雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)的人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J 小鼠的受精卵中，用ICR 小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.2.2 PCR 鑒定GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d 用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，用PCR 法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)。PCR 上游引物為:5′－GATGAGGACCGAAGTGATTGT，下游引物為:5′－TTGCCCAGGTTGTAAATGTG。PCR 反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)變性到延伸29 次，完成30 個(gè)循環(huán)。目的基因片段為623 bp。

1.2.3 Western Blot 鑒定GRK4γwt/R65L/A142V/A486V蛋白的表達(dá)

提取首建鼠的仔代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩轉(zhuǎn)基因陰性(non－transgenic，NTG)小鼠心臟、腎臟和腎上腺組織總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE 凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，置于5% 脫脂奶粉中封閉，鼠抗GRK4 抗體檢測(cè)鼠源GRK4 和轉(zhuǎn)入的人源GRK4 蛋白的表達(dá)水平，HRP－偶聯(lián)的羊抗鼠抗體結(jié)合一抗，HRP－偶聯(lián)的GAPDH 單克隆抗體作為內(nèi)參。

1.2.4 無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓

將小鼠提前半小時(shí)放入血壓測(cè)量實(shí)驗(yàn)室，讓小鼠適應(yīng)測(cè)試環(huán)境。按智能無創(chuàng)血壓計(jì)說明書和Steven E 報(bào)道的方法進(jìn)行小鼠尾部血壓測(cè)量［15］。

1.2.5 高鹽飼料喂養(yǎng)GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠

于2 月齡給予NTG 小鼠和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因高鹽飼料(氯化鈉含量為4%，，連續(xù)喂養(yǎng)4 周后用智能無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量血壓并恢復(fù)正常飼料(氯化鈉含量為0.6%)喂養(yǎng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 GRK4γwt/R65L/A142V/A486V轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

測(cè)序結(jié)果表明PCR 法克隆的片段同已報(bào)道人組織GRK4 序列完全一致(GeneBank:NC_000004)，將人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因分別插入雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下游，構(gòu)建得到人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(圖1A)并用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。提取小鼠基因組DNA，用PCR 法擴(kuò)增623 bp 的目的片段，鑒定小鼠基因型(圖2B)。提取心臟、腎臟和腎上腺組織總蛋白，用GRK4 抗體進(jìn)行Western Blot 分析，確定轉(zhuǎn)基因小鼠GRK4 的高表達(dá)(圖1C)。通過比較NTG和轉(zhuǎn)基因小鼠中GRK4 表達(dá)水平，篩選到在心臟、腎臟和腎上腺均高表達(dá)GRK4 基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。

2.2 正常飲食 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V 轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析

NTG 和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠于2、4 和8 月齡進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，NTG 和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure，MBP)［平均動(dòng)脈血壓 = 舒張壓 + 1/3(收縮壓﹣舒張壓)］均隨著年齡的增長而增加。與NTG 小鼠相比，GRK4γ野生型和 GRK4γR65L轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常;GRK4γA142V轉(zhuǎn)基因小鼠在8 月齡時(shí)血壓顯著升高(P=0.009);而GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下并未出現(xiàn)高血壓表型(圖2)。說明，外源性轉(zhuǎn)入人源 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突變不會(huì)影響正常鈉鹽攝入情況下血壓水平，而GRK4γA142V突變即使在正常鈉鹽攝入情況下仍會(huì)引起血壓升高。

2.3 高鹽飲食GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析

于2 月齡時(shí)將NTG 和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成四組，即NTG 正常飲食組(n = 8)、GRK4γA486V正常飲食組(n =5)、NTG 高鹽飲食組(n=6)和GRK4γA486V高鹽飲食組(n =6)。正常膳食飲食組飼料中氯化鈉含量為0.6%，高鹽飲食組飼料中氯化鈉含量為4%，連續(xù)喂養(yǎng)4 周后恢復(fù)正常飲食，并對(duì)各組小鼠進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過高鹽飲食刺激，與正常飲食組NTG 小鼠相比，高鹽飲食組NTG 小鼠MBP 雖有所升高但差異無顯著性;而高鹽飲食組GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠較正常飲食組GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠MBP 顯著升高(P =0.0007)，且MBP 變化值為7.53 mmHg(圖3)。臨床上，將因鈉鹽攝入量增多而導(dǎo)致的MBP 升高值≥7 mmHg 的高血壓定義為鹽敏感性高血壓［16］。由此可知，GRK4γA486V突變誘導(dǎo)高血壓屬于鹽敏感性高血壓。

圖1 GRK4γ 野生型基因和三種GRK4γ 基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠的建立Note:1.Blank control;2.negative control;3.positive control;5，8，11，13:positive tranggenic Mice;4，6，7，9，10，12:Negative transgenic mice.A.Establishment of GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic vector;B.Genotyping GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic mice by PCR;C.Expression level of target gene in the heart，kidney and adrenal gland by Western blot.Fig.1 Establishment of GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic mice

圖2 正常飲食GRK4γ 野生型基因和三種GRK4γ 基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析(Note:* P＜0.01;＊＊P＜0.01)Fig.2 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure of GRK4γ wildtype gene and three GRK4γ variant transgenic mice taking normal diet

圖3 高鹽飲食GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析Fig.3 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure of GRK4γA486V transgenic mice taking in high－salt diet

3 討論

多巴胺能和腎素－血管緊張素系統(tǒng)是兩個(gè)最主要的血壓調(diào)控途徑，二者與細(xì)胞間第二信使系統(tǒng)協(xié)同調(diào)節(jié)體內(nèi)水鈉平衡，GRK4 則在多巴胺介導(dǎo)的尿鈉排泄中發(fā)揮重要的作用。研究表明，GRK4γ 野生型可以促進(jìn)細(xì)胞間的D1R 募集至細(xì)胞膜，與第二信使偶聯(lián)，增加鈉運(yùn)輸［17］;而GRK4γ 突變體卻可通過使D1R 磷酸化及內(nèi)在化，阻止其再循環(huán)至細(xì)胞膜，并引起D1R 與第二信使解偶聯(lián)，鈉轉(zhuǎn)運(yùn)減少，鈉鉀離子ATP 酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高和血管平滑肌活性增高等一系列功能異常，最終導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。再者，GRK4γ 突變體還可通過調(diào)控其他基因的表達(dá)，如增加AT1R 的表達(dá)，增強(qiáng)抗尿鈉排泄效應(yīng)，刺激血壓升高［18］。Felder 等［19］發(fā)現(xiàn)，抑制腎GRK4 的表達(dá)可恢復(fù)高血壓患者腎近曲小管D1R功能并改善自發(fā)性高血壓大鼠的血壓水平。但目前對(duì)GRK4 的表達(dá)調(diào)控所知甚少，僅Gildea 等［20］在近期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c－Myc 可與GRK4 啟動(dòng)子結(jié)合，正調(diào)控人腎臟近曲小管細(xì)胞中GRK4 蛋白的表達(dá)。c－Myc 的抑制劑10074－G5 可完全抑制由磷酸化c－Myc誘導(dǎo)的GRK4 表達(dá)增高，說明GRK4 是轉(zhuǎn)錄因子c－Myc 的下游分子。此研究還發(fā)現(xiàn)，腎臟近曲小管細(xì)胞自分泌的血管緊張素Ⅱ也可刺激磷酸化c－Myc 和GRK4 的表達(dá)，若給予血管緊張素ⅡAT1R 的抑制劑洛沙坦不僅可抑制c－Myc 活性及GRK4 的表達(dá)，還能恢復(fù)D1R 與第二信使的偶聯(lián)，改善血壓水平。

本文建立了人GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因轉(zhuǎn)基因小鼠，并對(duì)其進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NTG 小鼠相比，GRK4γ 野生型和GRK4γR65L突變轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常;GRK4γA142V突變轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下即可發(fā)生高血壓，而GRK4γA486V突變轉(zhuǎn)基因小鼠只有在增加鈉鹽攝入情況下才發(fā)生高血壓。Felder［19］和Wang 等［21］也得出類似的結(jié)果，說明GRK4γ 的不同突變會(huì)引起不同類型的高血壓。

GRK4γ 基因的突變與高血壓的關(guān)系對(duì)臨床上防治高血壓具有重要的指導(dǎo)意義，已有報(bào)道，非洲裔美國高血壓患者若其帶有GRK4γR65L/A142V突變，則對(duì)β－腎上腺素受體阻滯劑不敏感［22］;而血管緊張素受體阻滯劑可明顯降低帶有GRK4γA142V突變的日本高血壓患者的血壓水平［23］。

綜上所述，GRK4，尤其是人GRK4γ 亞型，在調(diào)節(jié)D1R 生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用，與高血壓密切相關(guān)。人GRK4 突變體不僅可以預(yù)測(cè)高血壓的類型(如，自發(fā)性高血壓、鹽敏感性高血壓)，還可預(yù)期高血壓患者對(duì)抗高血壓藥物的反應(yīng)。本文建立GRK4γA142V轉(zhuǎn)基因小鼠可作為自發(fā)性高血壓動(dòng)物模型，GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠可作為鹽敏感性高血壓動(dòng)物模型，為研究GRK4γ 突變與高血壓發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供了有價(jià)值的疾病動(dòng)物模型。

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