DREBs、bZIP轉(zhuǎn)錄因子與植物抗旱性研究進(jìn)展

劉 莉

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用工程系，浙江 杭州 310018)

水資源短缺、干旱是目前公認(rèn)的全球性環(huán)境問題，全球干旱半干旱地區(qū)約占陸地面積的35%，遍及世界60多個國家和地區(qū)。中國是受干旱影響嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)大國，據(jù)水利部統(tǒng)計， “十五”期間，全國農(nóng)田受旱面積年均達(dá)2 567萬 hm2，平均每年因旱減產(chǎn)350億kg，造成經(jīng)濟(jì)損失超過2 300億元。干旱脅迫正嚴(yán)重制約著農(nóng)作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮。同時，由于經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展過程中對污染物處理不盡合理，導(dǎo)致我國70%的內(nèi)陸河流遭到污染，成為水質(zhì)性缺水嚴(yán)重的國家。因此，發(fā)掘和利用作物對干旱脅迫的耐性和適應(yīng)性，對于充分利用土地與自然資源、穩(wěn)定與發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有非常重要的意義。

植物通過多種生理機制在細(xì)胞、組織和植株水平上響應(yīng)水分脅迫，避免或減輕缺水對其細(xì)胞的傷害［1］，在干旱條件下，植物體內(nèi)會積累大量的代謝物質(zhì)如糖類、氨基酸 (如脯氨酸)、多胺、季胺、無機離子 (如K+)等，以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)滲透勢;啟動抗氧化防御系統(tǒng)，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、過氧化物酶(POD)等抗氧化酶活性及Ve、還原型谷胱苷肽(GSH)等抗氧化物質(zhì)，協(xié)同抵抗干旱脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害;相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，一些正?；虮魂P(guān)閉，而一些與適應(yīng)逆境有關(guān)的基因則被啟動，表現(xiàn)出正常蛋白合成受阻，誘導(dǎo)合成特異蛋白即逆境蛋白［2-4］。通常，植物許多基因的表達(dá)需要通過特定的轉(zhuǎn)錄因子與特定的順式作用元件相互作用調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子 (transcription factor，TF)又稱反式作用因子，是能與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，從而保證目的基因以特定強度、特定時間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。與抗逆相關(guān)、編碼產(chǎn)物參與信號傳遞途徑和基因表達(dá)調(diào)控過程的轉(zhuǎn)錄因子主要分為 MYB、bZIP、WRKY、AP2/EREBP和NAC類5個家族。其中，堿性亮氨酸拉鏈 (bZIP，basic region/leucine zipper motif)轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與種子貯藏基因表達(dá)、植物生長發(fā)育、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病害防御、生物和非生物脅迫應(yīng)答以及ABA敏感性等各種信號的反應(yīng);與干旱應(yīng)答元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 (DREBs，dehydration responsive element binding)，可特異的識別并結(jié)合干旱應(yīng)答元件 (DRE，dehydrationresponsive element)，進(jìn)而參與逆境信號的傳遞，調(diào)控下游逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，提高植物在逆境條件下的適應(yīng)性和耐受能力。

1 植物對干旱信號的感知和傳導(dǎo)

植物抗旱機能的實現(xiàn)要通過對水分脅迫感知、脅迫信號傳導(dǎo)及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控等一系列復(fù)雜的生理生化過程。從環(huán)境刺激到植物對逆境作出反應(yīng)是一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)過程，它包括以下3個環(huán)節(jié):一是細(xì)胞對環(huán)境信號的感知轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生胞間信使;二是胞間信使在細(xì)胞或組織間傳遞，并最終到達(dá)受體細(xì)胞的作用位點;三是受體細(xì)胞對胞間信使的接受轉(zhuǎn)導(dǎo)和反應(yīng)，導(dǎo)致受體組織中生理生化和功能的最優(yōu)化組合，最終體現(xiàn)為植物對環(huán)境刺激或逆境的適應(yīng)或抗性。盡管從分子水平上還不能完全闡明這些過程，但已有一些研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞可以通過膨壓變化或膜受體的活性變化感知水分脅迫，從而將胞外信號轉(zhuǎn)為胞內(nèi)信號，觸發(fā)信號傳遞途徑。在植物中可分為依賴ABA和不依賴ABA的2類途徑，參與水分脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)，不同的傳遞途徑之間存在交叉轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。已有證據(jù)表明調(diào)滲蛋白 (OSM)啟動子受ABA和乙烯轉(zhuǎn)錄水平上的活化。

細(xì)胞失水引起的膨壓變化或膜受體的活性變化可能是細(xì)胞感知干旱信號的原因，并因此發(fā)出信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。隨著水分脅迫的進(jìn)一步加劇，第2級的信號諸如第2體與幾種可能的受體 (如受體類的蛋白激酶、組氨酸激酶、與G蛋白相關(guān)的膜蛋白受體等)相結(jié)合，觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。與干旱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的第2信使可能有以下幾種類型:Ca2+、磷脂、ROS和胞質(zhì)pH。

植物通過多種途徑感受并轉(zhuǎn)導(dǎo)干旱脅迫信號，激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，激活RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種基因表達(dá)產(chǎn)物，對內(nèi)、外界信號做出調(diào)節(jié)反應(yīng)，從而增強對逆境的抗 (耐)性［5］。

2 DREB轉(zhuǎn)錄因子

DREB轉(zhuǎn)錄因子是與DRE順式作用元件結(jié)合的反式作用因子。DREBs轉(zhuǎn)錄因子可特異識別并結(jié)合DRE，進(jìn)而參與逆境信號的傳遞，調(diào)控下游逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，提高植物在多種逆境條件下的適應(yīng)性和耐受能力。DREB1A/B/C和DREB2類轉(zhuǎn)錄因子分別參與不依賴于ABA的低溫、干旱或高鹽等脅迫應(yīng)答途徑;而DREB1D/CBF4則參與依賴ABA的干旱或高鹽等應(yīng)答途徑。Liu等［6］從干旱處理的擬南芥cDNA文庫中克隆到2個與DRE元件結(jié)合，在干旱、高鹽脅迫下調(diào)控報告基因gus表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 DREB2A和 DREB2B。Jaglo-Ottosen等［7］利用擬南芥 CBF1基因 (即 DREB1B基因)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化培育出耐寒性增強的擬南芥植株。李晶等［8］將擬南芥 DREB1A基因分別在組成型啟動子CaMV 35S和逆境誘導(dǎo)型啟動子rd29A的驅(qū)動下轉(zhuǎn)入煙草中，獲得的2種轉(zhuǎn)基因煙草，對干旱和低溫脅迫的抗性均顯著提高。隨著對擬南芥DREBs類轉(zhuǎn)錄因子研究的深入，其他植物中DREBs類基因家族的研究也得以不斷深入?，F(xiàn)有研究表明，含DREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于擬南芥、小麥、煙草、水稻、玉米、黑麥和番茄等植物中，分別與細(xì)胞發(fā)育、激素、抗病、低溫以及干旱、高鹽等信號有關(guān)，在各種基因表達(dá)中起重要的調(diào)控作用［9-18］

近年來，通過對DREBs類轉(zhuǎn)錄因子功能的研究深入，發(fā)現(xiàn)DREBs在干旱脅迫適應(yīng)性及抗性中具有重要作用，1個DREB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽和低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(dá)［19］。Sakuma 等［13］將 35S:AtDREB1A 和 35S:AtDREB2A CA轉(zhuǎn)化擬南芥，干旱處理2周，野生型全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植株的存活率分別為60%和83.3%。Chen等［20］從大豆中克隆 GmDREB2轉(zhuǎn)錄因子，并將其轉(zhuǎn)化擬南芥，干旱處理19 d，野生型全部死亡，轉(zhuǎn)基因植株的成活率分別為45.9%和21%。Sakuma等［21］通過對 DREB2A-CA過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥中DREB2A的上調(diào)基因進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)DREB2A-CA不僅可以誘導(dǎo)下游干旱脅迫基因，也可誘導(dǎo)熱激和鹽脅迫相關(guān)基因表達(dá)。劉強等［19］報道，在轉(zhuǎn)基因植物中，由于超量表達(dá)DREB1，不僅使rd29A、kinl、cor6.6和corl5a基因在正常條件下表達(dá)，而且在干旱或低溫脅迫條件使rd29A、kinl、cor6.6、corl5a，以及 rd17、rd10 基因的表達(dá)顯著高于野生型，植物對干旱及低溫的耐性也隨之顯著增強。耿芳等［18］采用同源克隆及cDNA末端快速擴(kuò)增法 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)，從煙草中克隆到 1個新的煙草DREB基因，命名為 NbDREB2a，序列分析表明，該基因具有典型的 DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結(jié)構(gòu)域，是植物DREB基因家族的一員，實時定量RT-PCR分析表明，該基因能在煙草的根、莖、葉中表達(dá)，受低溫、干旱和高鹽誘導(dǎo)，說明該基因在植物的抗逆反應(yīng)中起重要作用;在擬南芥中超量表達(dá)NbDREB2a基因能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗干旱及高鹽的能力。于洋等［22］對轉(zhuǎn) DREB1A基因地被菊進(jìn)行了耐旱節(jié)水性研究，結(jié)果表明，在6個轉(zhuǎn)基因地被菊株系中有5個株系的耐旱節(jié)水性優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因的野生型植株，而且轉(zhuǎn)基因株系的耐旱能力在高溫條件下表現(xiàn)得更為突出，由此說明外源DREB1A基因的導(dǎo)入能激活植物體內(nèi)與抗逆性相關(guān)的基因的表達(dá)，從而增強轉(zhuǎn)基因地被菊對干旱的脅迫耐性。

近年來，人們正在進(jìn)行水稻、棉花、玉米等DREB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定工作，期望能使DREB轉(zhuǎn)錄因子以及DRE元件的啟動子在改良植物抗逆性的基因工程中得到應(yīng)用。Gao等［23］從陸地棉泗棉3號cDNA文庫克隆了GhDREB轉(zhuǎn)錄因子，GhDREB編碼含有保守AP2/EREBP域的蛋白質(zhì) (含153個氨基酸)，RNA印跡分析表明，干旱、高鹽和冷害誘導(dǎo)GhDREB基因表達(dá)，其編碼的 GhDREB蛋白質(zhì)能與DRE核心元件 (A/GCCGAC)特異結(jié)合;轉(zhuǎn)GhDREB基因小麥的功能分析顯示，轉(zhuǎn)基因小麥與野生型的表型間無顯著差異，但耐干旱、鹽害和凍害能力顯著高于野生型。Wang等［17］從玉米幼苗中分離克隆到ZmDBP3基因，研究顯示ZmDBP3合成的CRT/DRE-binding轉(zhuǎn)錄因子在改善植物耐旱和耐冷性中具有重要作用，ZmDBP3為CBF/DREB亞族A-1亞組成員，ZmDBP3蛋白包含一個假定的核定位信號和激活區(qū)域，低溫和鹽害激活ZmDBP3高度轉(zhuǎn)錄;轉(zhuǎn)基因ZmDBP3超表達(dá)擬南芥顯著提高植株的耐干旱和低溫能力。當(dāng)水稻遭遇干旱脅迫時個別基因表達(dá)發(fā)生變化，這些基因包括MAPK(mitogen activated protein kinase)［24］， DREB(drought regulatory element binding)基因［12］，翻譯延伸因子［25］和谷胱甘肽還原酶［26］等基因。水稻全基因組保守序列研究顯示水稻中存在幾個DREB基因，例如:OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D，OsDREB1F，OsDREB2A，OsDREB4-1和 OsDREB4-2［12，27-28］。轉(zhuǎn)基因水 稻 中 OsDREB 引起脅迫響應(yīng)基因的強烈表達(dá)，結(jié)果顯著提高抗干旱、鹽害和冷凍脅迫能力［29-30］。

3 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子

植物堿性亮氨酸拉鏈bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣、最保守的一類蛋白。目前，在擬南芥、豆科植物和水稻基因組中發(fā)現(xiàn)大量的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的差異，可劃分為 A、B、C、D、E、F、G、H、I、S 10個亞族。這些不同家族的bZIP轉(zhuǎn)錄因子成員廣泛參與種子貯藏基因表達(dá)、植物生長發(fā)育、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病害防御、生物和非生物脅迫應(yīng)答以及ABA敏感性等各種信號的反應(yīng)［31-33］。迄今還沒有充分的實驗數(shù)據(jù)證實不同bZIP轉(zhuǎn)錄因子亞族成員在生理進(jìn)程中存在功能交叉，但這種分類對功能分析是一個重要的開始，對bZIP基因各家族的鑒定為進(jìn)一步剖析單個bZIP蛋白的功能奠定了重要的基礎(chǔ)。目前，A亞族成員是研究最為廣泛的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，在逆境脅迫誘導(dǎo)下調(diào)控下游植物基因的表達(dá)。Kang等［34］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)系統(tǒng)研究了 bZlP轉(zhuǎn)錄因子ABF3/ABF4在干旱和鹽脅迫中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中組成型表達(dá)bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABF3或ABF4可提高植株耐干旱能力。

ABRE(ABA-responsive element)在依賴ABA的基因表達(dá)中作為順式作用元件，AREB1是在ABA誘導(dǎo)基因的啟動子區(qū)域與ABRE亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥AREB1已被證明通過增加對脫落酸的敏感性來提高抗旱性 ［35］。在脅迫條件下，bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以與ABA誘導(dǎo)基因的啟動子區(qū)域的ABRE結(jié)合來調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。干旱、高鹽或外源脫落酸能誘導(dǎo)內(nèi)源脫落酸的合成，bZIP類型的轉(zhuǎn)錄因子也隨之被激活，并結(jié)合在ABRE上。ABRE存在于許多ABA誘導(dǎo)基因的啟動子序列，具有結(jié)合bZIP蛋白的結(jié)合序列，兩者相互作用使下游許多耐鹽和耐旱等抗性相關(guān)基因得以表達(dá)。目前，已經(jīng)從植物中分離到大量與ABRE相互作用的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，如煙草TAF-1、水稻 OsBZ8、TRAB1、擬南芥 ABF1～4、玉米ABP9、大 麥 HvABI5 和 HvVP1 等［21，36-39］。 Choi等［10］用酵母 One-Hybrid的方法，克隆了擬南芥ABF/AREB bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，其成員分別為:ABF1、 ABF2/AREB1、 ABF3、 ABF4/AREB2。 其中，ABF2/AREB1和ABF4/AREB2主要參與ABA、干旱、高鹽、熱和氧化脅迫等的應(yīng)答反應(yīng)。Class等［40］從水稻胚cDNA文庫中篩選到 bZIP蛋白質(zhì)家族的轉(zhuǎn)錄因子OSBZ8基因，其編碼的蛋白質(zhì)能與ABA誘導(dǎo)抗性基因如 Em，Osem，rabI6等 ABRE中的 G-box特異結(jié)合。Xiang等［41］研究發(fā)現(xiàn)，OsbZIP23轉(zhuǎn)基因水稻，干旱脅迫下體內(nèi) (細(xì)胞核)ABA依賴型OsbZIP23超量表達(dá)，結(jié)果其耐旱性顯著高于野生型。Lu等［42］報道，轉(zhuǎn)基因水稻過度表達(dá)OsbZIP72，表現(xiàn)出對ABA敏感，顯著提高LEAs等ABA響應(yīng)基因的表達(dá)水平，并顯著增強耐旱能力，表明OsbZIP72對改良水稻耐旱性具有潛在應(yīng)用價值。這類基因還有大麥 hvABI5，擬南芥ABI3和 ABI5 等［43-44］。

4 小結(jié)

從不同水平上了解作物的抗旱機制有助于培育抗旱作物品種，提高干旱條件下作物產(chǎn)量。轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答過程中扮演著重要的角色，通過揭示轉(zhuǎn)錄因子在植物干旱脅迫應(yīng)答過程中的作用機制，導(dǎo)入或改良一個轉(zhuǎn)錄因子，促

使多個功能基因發(fā)揮作用，達(dá)到提高作物抗逆性的效果。近年來在植物轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆和功能研究方面取得了很大進(jìn)展，同時也鑒定出多種與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的順式作用元件，如 G盒、W盒、CRT/DRE等。在以后的研究中，利用不斷發(fā)展和完善的基因工程技術(shù)，如基因芯片、蛋白互作、突變體分析等，有望對植物 DREBs、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境抗性中的作用機理進(jìn)行深入的研究，許多新功能將被逐步發(fā)現(xiàn)，這將促進(jìn)對它們在基因表達(dá)與調(diào)控中所起作用的認(rèn)識，并將有利于DREBs、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子在基因工程研究中的廣泛應(yīng)用，為外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效穩(wěn)定表達(dá)拓寬道路，為利用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行植物抗逆基因工程改良提供理論依據(jù)。迄今已有多種植物如水稻、小麥、煙草、地被菊等被轉(zhuǎn)化獲得了抗旱轉(zhuǎn)基因植株［8，22-23，45］，隨著抗旱分子生物學(xué)研究的深入和生物技術(shù)的進(jìn)步，相信不久的將來會有更多的抗旱基因作物應(yīng)用到生產(chǎn)實踐。

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