代謝組學(xué)在肝功能衰竭中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

李莎莎，余祖江，闞全程

本文文獻(xiàn)檢索策略：

計(jì)算機(jī)檢索萬方數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)及PubMed等數(shù)據(jù)庫，以“肝功能衰竭”“代謝組學(xué)”及“l(fā)iver failure”“metabolomics”為檢索詞，參考國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)寫作層次，收集關(guān)于肝功能衰竭代謝組學(xué)方面的研究并記錄；根據(jù)診斷、病變程度及病因3個(gè)方面進(jìn)行分類，分析、總結(jié)其代謝組學(xué)研究方法及特點(diǎn)。

我國病毒性肝炎發(fā)病率高，且每年因肝病死亡的人數(shù)達(dá)50萬以上。病毒性肝炎發(fā)展至肝功能衰竭后病死率極高，但肝功能衰竭的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療及預(yù)防仍是目前研究的難題。肝臟是人體內(nèi)最重要的解毒器官，也是物質(zhì)能量的代謝中心，對各種藥物、毒物和體內(nèi)的大多數(shù)代謝產(chǎn)物具有轉(zhuǎn)化作用。肝臟病變進(jìn)展會導(dǎo)致體內(nèi)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化系統(tǒng)發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)變，并對其內(nèi)源性小分子化合物產(chǎn)生相應(yīng)影響[1]。代謝組學(xué)從小分子物質(zhì)的角度研究肝功能衰竭的相關(guān)過程，通過對代謝物及其轉(zhuǎn)化途徑的分析可以更好地了解肝功能衰竭相關(guān)病理過程，在肝病研究中具有重要意義。此外，對肝功能衰竭的代謝組學(xué)研究有助于發(fā)現(xiàn)具有診斷價(jià)值的特異性標(biāo)志物[2]，如乳酸、丙戊酸等，本文對以上內(nèi)容進(jìn)行了綜述。

1 代謝組學(xué)的概念、研究層次、分類及整合

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后一個(gè)新興的后基因組學(xué)的研究領(lǐng)域，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[3]。代謝組學(xué)通過研究生物體血漿、尿液、組織液、細(xì)胞培養(yǎng)液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，定性、定量地反映生物體在不同時(shí)間及環(huán)境下的功能狀態(tài)；此外，生物體組織、器官也可以作為樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究[4]。

基于不同研究目的和研究對象，F(xiàn)iehn等[5]將代謝組學(xué)分為4個(gè)研究層次：代謝物靶標(biāo)分析、代謝譜分析、代謝物組及代謝指紋分析(對樣本進(jìn)行快速的定性)。目前，肝功能衰竭的代謝組學(xué)研究主要于代謝指紋分析層次上開展。

代謝組學(xué)研究的技術(shù)手段主要包括核磁共振(NMR)、氣象色譜(GC)、液相色譜(LC)、質(zhì)譜(MS)、毛細(xì)管電泳(CE)、紅外光譜、紫外光譜等，目前應(yīng)用最廣泛的是NMR、GC-MS聯(lián)用技術(shù)及LC-MS聯(lián)用技術(shù)。由于代謝組學(xué)的研究對象是內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物(相對分子質(zhì)量<1 000 Da)[6-7]，如糖、脂質(zhì)、膽汁酸、肉毒堿、氨基酸等，而種類繁多的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物在體內(nèi)分布范圍較廣，因此常需通過聯(lián)合多種技術(shù)手段才能夠分析出特殊條件下的各種代謝產(chǎn)物[8-9]。

代謝組學(xué)具有高通量性和大規(guī)模性，相對單一的研究樣本、檢測技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法需要進(jìn)一步整合以滿足代謝組學(xué)研究需求，因此逐漸出現(xiàn)了代謝組學(xué)的整合。目前代謝組學(xué)的整合主要包括：(1)研究樣本的整合：體液、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織等；(2)檢測技術(shù)的整合：NMR與MS的聯(lián)合應(yīng)用，GC-MS聯(lián)用技術(shù)和核磁共振氫譜(1H-NMR)等[10-11]；(3)數(shù)據(jù)處理方法的整合：對不同的多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)一步整合，尤其是聯(lián)合了無監(jiān)督及有監(jiān)督的多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，以探索肝病患者與健康人之間、不同的肝病患者之間的代謝途徑并發(fā)現(xiàn)潛在的代謝組學(xué)標(biāo)志物[12-16]；(4)組學(xué)間的整合：代謝組學(xué)可以通過整合蛋白組學(xué)及基因組學(xué)從而更全面、更系統(tǒng)地了解生物體代謝物與蛋白、基因的關(guān)系。

2 代謝組學(xué)在肝功能衰竭中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

肝功能衰竭是指短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的肝臟大面積壞死，肝臟合成清蛋白、解毒各種毒性物質(zhì)、防御病毒細(xì)菌入侵及分泌細(xì)胞因子等功能均受到嚴(yán)重創(chuàng)傷，患者臨床表現(xiàn)為凝血功能障礙、黃疸、腹腔積液及肝性腦病等[17-19]，臨床癥狀多表現(xiàn)為極度乏力、食欲下降、腹脹、惡心、嘔吐、醫(yī)師改變等[20]。對代謝產(chǎn)物的分析在肝功能衰竭的早期診斷及治療中非常重要，肝功能衰竭的代謝組學(xué)研究是一個(gè)全新的視角，在肝功能衰竭的診斷、病情嚴(yán)重程度判斷、病因分析中具有重要的臨床價(jià)值。

2.1 診斷 肝臟主要通過一些小分子物質(zhì)與其他器官進(jìn)行聯(lián)系，代謝組學(xué)通過對這些小分子物質(zhì)尤其是血液中的小分子物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肝功能衰竭患者與普通肝病患者的不同之處，以便早期明確肝功能衰竭的診斷。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)可以區(qū)分不同代謝產(chǎn)物的峰值，再應(yīng)用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)發(fā)現(xiàn)病情惡化的代謝產(chǎn)物，如鵝脫氧膽堿甘氨酸、溶血磷脂酰膽堿等。Yang等[21]應(yīng)用HPLC-MS對37例慢性乙型肝炎急性肝功能衰竭患者及50例健康者的血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，并應(yīng)用PLS-DA發(fā)現(xiàn)鵝脫氧膽堿甘氨酸(GCDCA)的個(gè)別原子及溶血磷脂酰膽堿(LPc)發(fā)生了改變，其認(rèn)為這些代謝產(chǎn)物的變化對急性肝功能衰竭有一定的診斷價(jià)值，可能是急性肝功能衰竭的潛在生物標(biāo)志物。

1H-NMR可根據(jù)不同代謝產(chǎn)物的信號峰值對其進(jìn)行區(qū)分，代謝產(chǎn)物經(jīng)過檢測、分析和鑒定后即進(jìn)入數(shù)據(jù)分析階段，主成分分析(PCA)是最常用的數(shù)據(jù)分析技術(shù)[22]，而基于多變量的PCA可以對原始譜圖降維，再對所有樣本進(jìn)行分析后就可以給出不同樣本的代謝差異。Yang等[23]應(yīng)用1H-NMR對重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭患者的血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，并應(yīng)用PCA發(fā)現(xiàn)重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭患者血清乙酰乙酸鹽、蛋氨酸、三甲胺和葡萄糖水平較正常人明顯升高，而膽堿、乳酸和脂質(zhì)水平明顯降低。其認(rèn)為上述代謝產(chǎn)物的變化對區(qū)分正常人和重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭具有重要意義，可作為重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭在分子水平上的診斷依據(jù)。GS-MS聯(lián)用技術(shù)可通過質(zhì)譜庫對代謝產(chǎn)物譜峰和峰相對面積進(jìn)行識別，再結(jié)合PCA、典型判別分析(CDA)及其他計(jì)算方法對其進(jìn)一步計(jì)算和判別。Mao等[24]通過GS-MS聯(lián)用技術(shù)對不同的生物標(biāo)志物進(jìn)行識別，再應(yīng)用3種不同的計(jì)算方法找出最優(yōu)的特征子集，從而獲得了93.62%的肝功能衰竭診斷正確率，并且發(fā)現(xiàn)了血漿檸檬酸鹽是一種重要的標(biāo)志物。Feng等[25]應(yīng)用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對急性肝功能衰竭大鼠血清代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，并聯(lián)合PCA軟件分析發(fā)現(xiàn)血清5-羥吲哚乙酸、β-羥丁酸鹽、葡萄糖和磷酸鹽水平增高，認(rèn)為這些代謝產(chǎn)物變化對急性肝功能衰竭有一定的診斷價(jià)值。

2.2 病變嚴(yán)重程度 病變嚴(yán)重程度對于肝功能衰竭診斷、分類及預(yù)后判斷有非常重要的意義，但傳統(tǒng)的肝組織活檢對于凝血功能嚴(yán)重降低的肝功能衰竭患者來說具有非常高的危險(xiǎn)性，因此從代謝組學(xué)的角度研究肝功能衰竭嚴(yán)重程度對臨床工作很有幫助。

NMR通過對不同樣本的輻射頻率進(jìn)行掃描，進(jìn)而形成共振峰及圖譜，可完整、快速地對生物體的血漿、組織液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等樣本進(jìn)行檢測，與其他檢測方法相比，其優(yōu)勢在于重復(fù)性較好、對樣本的預(yù)處理相對簡單[26]。Amathieu等[14]應(yīng)用500 MHz高場NMR技術(shù)分析肝硬化患者血清小分子物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)輕度肝功能衰竭的肝硬化患者血清磷酸膽堿及高密度脂蛋白水平較嚴(yán)重肝功能衰竭的肝硬化患者明顯升高，而血清乳酸、葡萄糖、丙酮酸、氨基酸及肌酐水平明顯降低。

在結(jié)合GS-MS聯(lián)用技術(shù)和PCA等的前提下，通過終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)分析可以明確地對代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類。Yu等[27]采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對乙型肝炎急性肝功能衰竭患者進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，其血清葡萄糖及氨基酸表現(xiàn)的色譜圖有明顯不同，提示MELD分析通過圖形識別而區(qū)分不同嚴(yán)重程度的肝功能衰竭。

2.3 病因 肝功能衰竭是多種病因相互影響的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但具體機(jī)制目前尚不明確；了解其病因、發(fā)病機(jī)制對更好地診斷和治療肝功能衰竭非常必要。研究表明，引起肝功能衰竭的原因有地域差異，在我國主要是肝炎病毒引起，尤其是乙型肝炎病毒[28-29]，其次是肝毒性物質(zhì)(乙醇、化學(xué)制劑)和藥物等[30-31]；在歐美國家主要是藥物，如對乙酰氨基酚等[32]。Yang等[33]分別采用α-萘基異硫氰酸鹽及CCl4制作肝功能衰竭鼠模型進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間及其與對照組之間的血清膽汁酸峰值有明顯差異，而應(yīng)用CDA對血清膽汁酸水平進(jìn)一步區(qū)分并進(jìn)行分組的準(zhǔn)確率高達(dá)97.5%，提示血清膽汁酸水平可以為肝功能衰竭的病因分析提供重要依據(jù)。由于國內(nèi)外關(guān)于肝衰竭病因的代謝組學(xué)研究較少，其相關(guān)的作用機(jī)制仍有待深入研究，隨著更多代謝組學(xué)研究方法在肝功能衰竭病因方面的應(yīng)用，可以進(jìn)一步從病因及發(fā)病機(jī)制方面來更好地了解肝功能衰竭這一肝臟疾病中的難題。

3 小結(jié)

代謝組學(xué)在肝功能衰竭中的應(yīng)用具有很大優(yōu)勢，應(yīng)用前景良好，雖然目前代謝組學(xué)相關(guān)的研究較多，但代謝組學(xué)的發(fā)展仍處于早期階段，而由于檢測樣本的個(gè)體差異，如生理因素、技術(shù)手段、數(shù)據(jù)處理、產(chǎn)物識別等原因，對相關(guān)代謝產(chǎn)物或代謝途徑尚不能進(jìn)行全面的定性及定量分析。相信隨著整合代謝組學(xué)的發(fā)展及其在肝功能衰竭中的不斷應(yīng)用，攻克肝功能衰竭，闡明其發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行有效診斷和治療將為時(shí)不遠(yuǎn)。

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