布魯氏菌和宿主相互作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張維珍

（長春市農(nóng)科院畜牧研究所，吉林長春 130111）

布魯氏菌?。˙rucellosis簡稱：布?。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N動(dòng)物傳染源的人畜共患傳染病。在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，WHO估計(jì)布病每年新發(fā)的病例是50萬人，是全世界范圍內(nèi)最頻繁發(fā)生的人畜共患傳染病之一[1]。布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，它的重要特征是網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)持續(xù)的細(xì)菌增殖，因此，了解布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存和免疫入侵機(jī)制是掌握布氏桿菌病致病性的關(guān)鍵。近年來，許多研究都在布魯氏菌與宿主相互作用關(guān)系方面取得進(jìn)展，這使得我們對布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)生存和免疫入侵有了一定的認(rèn)識。本文對布魯氏菌和宿主相互作用機(jī)制的研究概況進(jìn)行了綜述，著重介紹了病原性布魯氏菌持續(xù)性增殖的細(xì)胞內(nèi)生存和免疫入侵機(jī)制。

1 侵入宿主

牛種和羊種布魯氏菌侵入宿主主要是通過消化道系統(tǒng)或呼吸道途徑，但是他們也能通過皮膚黏膜接觸感染。小鼠通過呼吸道途徑感染羊種布魯氏菌比通過胃內(nèi)感染高104倍。盡管兩者存在著顯著的差別，但流行病學(xué)調(diào)查顯示大部分人類感染的病例都是通過食物傳播的?？赡艿脑蚴?，人通過污染的牛奶和奶酪感染羊種和牛種的布魯氏菌的情況比職業(yè)性的接觸氣溶膠感染的情況要更普遍[2～3]。

通過胃腸道感染的研究已經(jīng)證實(shí)，感染的過程是細(xì)菌和宿主的因素共同起作用的結(jié)果。牛種、羊種和豬種布魯氏菌的基因編碼有兩個(gè)尿素酶（Ure）。缺乏Ure1的突變體不能通過胃內(nèi)途徑有效的在小鼠體內(nèi)增殖，這個(gè)結(jié)果揭示，Ure1在通過消化道感染而不是全身感染的過程中發(fā)揮著特殊的作用[4～5]。尿素酶可能通過尿素產(chǎn)生CO2緩沖胃內(nèi)的低pH值發(fā)揮作用，有趣的是，缺乏尿素酶的綿羊附睪種布魯氏菌雖然也能在羊奶中存在，但是不能通過食物傳播感染人類，尿素酶可能也對人類的感染非常重要[6]。一旦布魯氏菌通過了胃，它們必須通過上皮組織障礙分散到全身。在結(jié)扎的小鼠和牛身上研究發(fā)現(xiàn)，牛種布魯氏菌定植在淋巴集結(jié)的固有膜下，說明淋巴集結(jié)是細(xì)菌進(jìn)入的港口[7～8]。體外研究羊種布魯氏菌運(yùn)送極化的人類上皮（包括M樣細(xì)胞）單層細(xì)胞結(jié)果顯示，M樣細(xì)胞是布魯氏菌通過黏膜表面分散全身的一條途徑[9]。

2 散布全身的各部位

2.1 布魯氏菌逃避免疫系統(tǒng)檢測的機(jī)制

最近的研究顯示布魯氏菌用主動(dòng)和被動(dòng)的機(jī)制來逃避固有免疫系統(tǒng)Toll樣受體的檢測[10]。連同NLRs家族，這些病原體識別受體像一個(gè)分子條形碼閱讀器一樣發(fā)揮功能，使宿主通過識別保守的病原生物表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPS）典型的組合來區(qū)別細(xì)菌和其他感染性病原體[11～12]。布魯氏菌被動(dòng)逃避TLR4受體的檢測是通過LPS的脂質(zhì)A的改變實(shí)現(xiàn)的。牛種布魯氏菌脂質(zhì)A包含比腸道細(xì)菌LPS（C12～C16）更長的脂肪酸殘基（C28），同時(shí)這個(gè)改變通過降低的布魯氏菌LPS的TLR4活性劑的活力極大地減少內(nèi)毒素成分[13]。另外，布魯氏菌LPS的抗炎癥的特征是抵抗補(bǔ)體C3的沉積。C3沉積導(dǎo)致過敏因子C3a和C5a的產(chǎn)生，這些過敏因子和TLRS對減少促炎癥的細(xì)胞因子起協(xié)同作用[14～17]。因此，布魯氏菌LPS的結(jié)構(gòu)特征允許它去逃避依靠TLR4和補(bǔ)體兩個(gè)不同的固有的檢測系統(tǒng)。

除了被動(dòng)的逃避固有免疫，牛種和羊種布魯氏菌調(diào)配一個(gè)能有效干擾TLR信號的蛋白?；罹腥镜倪^程中，TLR2，TLR4和TLR9對感染是非常重要的[18～20]。牛種基因組編碼兩個(gè)蛋白包含TIR受體區(qū)域：Btp1和BAB1-0756編碼的蛋白。Btp1抑制樹突狀細(xì)胞的成熟和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這種抑制是它能夠干擾布魯氏菌釋放TLR2和TLR4信號的結(jié)果，但它并沒有抑制TLR9信號。羊種布魯氏菌同等物質(zhì)TcpB。TcpB的異位表達(dá)導(dǎo)致聚泛素化和MAL的降低，TLR2和TLR4發(fā)出信號需要一個(gè)適配器，而TLR9則不需要[8，20～21]。

2.2 細(xì)胞內(nèi)生存

已經(jīng)證實(shí)，布魯氏菌在宿主巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)生存。巨噬細(xì)胞依靠細(xì)菌是否已受抗體的調(diào)節(jié)作用通過兩種不同的途徑吸收豬種和牛種布魯氏菌。存在脂質(zhì)筏的條件下，吸收不易受調(diào)節(jié)作用的細(xì)菌被認(rèn)為是在缺乏特異性抗體的感染早期發(fā)生的。有研究提出，布魯氏菌吸收的巨噬細(xì)胞有兩個(gè)受體：一個(gè)是和LPS相互作用的SR-A受體，另一個(gè)是牛種上綁定表面暴露的Hsp60的細(xì)胞內(nèi)PrPC[22～23]。布魯氏菌的調(diào)理作用導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吸收細(xì)菌增加了10倍，但是吞噬細(xì)胞吞噬正在復(fù)制的細(xì)菌的百分率被降低了。

細(xì)胞吸收豬種布魯氏菌后，液泡pH酸化到4.0～4.5。這個(gè)酸化過程是非常重要的，因?yàn)橛寐迕顾谹和氯化物中和細(xì)胞液泡的pH值可以抑制豬種布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[24-25]。其中一個(gè)原因是酸化的環(huán)境提供了一個(gè)在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌非常重要的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的毒力因子VirBⅣ型分泌系統(tǒng)降低的信號。

在巨噬細(xì)胞里，含有布魯氏菌的細(xì)胞液泡在吸收后開始被溶菌體融化。和酸化過程一樣，溶菌體融化對于復(fù)制室的發(fā)展也非常重要，因?yàn)樽璧K了后期的伴隨陰性主導(dǎo)的突變體降低布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的GTP酶Rab7的功能發(fā)揮。因此，減少T4SS表達(dá)的液泡的酸化是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的要求[26]。分泌的效應(yīng)器，一旦溶菌體和包含布魯氏菌的液泡融合，VirB T4SS可能限制溶菌體融合的程度或者排除溶菌體標(biāo)記物，因?yàn)閂irB突變體殘留在溶菌體內(nèi)而且也被降解。截至目前，已經(jīng)報(bào)道了T4SS的6個(gè)基層，包括VirB共調(diào)節(jié)因子A和C，和4個(gè)布魯氏菌公認(rèn)的效應(yīng)器，BPE123，BPE275，BPE005，和BPE043[27]。第二個(gè)布魯氏菌毒力因子是周質(zhì)的環(huán)狀葡聚糖，它已經(jīng)被涉及到吞噬溶菌體融合物。純化的環(huán)狀葡聚糖能從細(xì)胞的外膜中釋放膽固醇，打破脂質(zhì)層的組織結(jié)構(gòu)，表明在細(xì)胞感染過程中，從細(xì)胞外周質(zhì)中釋放的葡聚糖能打破富含吞噬體外膜富含膽固醇的微區(qū)，從此影響囊的白細(xì)胞聚集[28]。

在穿過晚期的胞小體后，布魯氏菌變成和粗糙型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)，而且在ER源的液泡中復(fù)制[29]。ER在蛋白的分泌物中發(fā)揮作用，這個(gè)途徑中關(guān)鍵的一步是運(yùn)輸泡從ER中出芽，即運(yùn)輸分泌物到高爾基體中。運(yùn)輸泡的出芽發(fā)生在ER叫做ER逃逸區(qū)的位置上，而且這個(gè)過程需要小的GTP酶 Sar1[30]。通過降低Sar1的活性，感染牛種布魯氏菌的巨噬細(xì)胞ER逃逸區(qū)的破壞可以阻止ER標(biāo)記物在含菌的液泡中的標(biāo)記物，同時(shí)也可以抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的復(fù)制。從這個(gè)結(jié)果中看出，牛種布魯氏菌定位到ER上依靠的是從ER出口區(qū)攔截膜的。除了許多ER蛋白以外，小的GT Rab1和Rab2和GAPDH已經(jīng)被確認(rèn)在液泡里含有布魯氏菌。這三種蛋白普遍地在ER到高爾基體的媒介物中（ERGIC），這個(gè)媒介物由被認(rèn)為是在ER和高爾基體之間的膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分類揀選的微管泡系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成。ERGIC的成熟要求的Rab2被布魯氏菌最大化的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所需要，因?yàn)樗茏璧KRab2和隱性突變體或和小干擾RNA共同發(fā)揮功能。和保守蛋白A（RicA）相互制約的羊種布魯氏菌Rab2蛋白，最近已經(jīng)被證實(shí)被定位到宿主細(xì)胞中，在宿主細(xì)胞中和Rab2的GDP上升方式相互制約[31]。雖然，RicA- Rab2相互作用的序列并沒有完全被了解，但是ricA突變體的表型在宿主細(xì)胞中被增加復(fù)制了。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明RicA- Rab2相互作用可能影響包含布魯氏菌的液泡以一種細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的方式成熟，從而有助于布魯氏菌和先天免疫系統(tǒng)“隱形”的相互作用。

為了完成細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而攔截在ER和高爾基體之間的膜轉(zhuǎn)運(yùn)的特性是和另一個(gè)病原菌——肺炎軍團(tuán)菌相一致的。然而，布魯氏菌錨定的ER的機(jī)理似乎和肺炎軍團(tuán)菌不同，它需要的是Rab1而不是Rab2，因?yàn)镽ab2并不能定位到含有肺炎軍團(tuán)菌的液泡中。敲除Rab1對布魯氏菌的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并無影響，表明布魯氏菌和肺炎軍團(tuán)菌調(diào)動(dòng)了不同的蛋白完成同時(shí)的復(fù)制過程。盡管，可能在兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)病原體之間的全部的策略中有著平行的出口，然而，肺炎軍團(tuán)菌T4SS效應(yīng)器調(diào)節(jié)Rab1的GTP酶的活性，布魯氏菌可能利用一個(gè)相似的策略去調(diào)節(jié)Rab2的活性和捕捉來自ER的膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[32～33]。

盡管布魯氏菌能大量的復(fù)制和獲得大量的膜在感染細(xì)胞里，野生型布魯氏菌的感染并不能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。感染的細(xì)胞經(jīng)歷正常細(xì)胞的分化，表明基本的細(xì)胞的過程并沒有因?yàn)椴剪斒暇母腥径艿接绊慬34]。而且，在感染的巨噬細(xì)胞中，被化學(xué)刺激物誘導(dǎo)的豬種布魯氏菌能抑制了正常的細(xì)胞死亡或凋亡。雖然，布魯氏菌抑制感染細(xì)胞的凋亡的正確的機(jī)理并不十分清楚，但是細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制似乎是需要的。兩個(gè)研究發(fā)現(xiàn)了關(guān)于布魯氏菌感染細(xì)胞得出的對細(xì)胞凋亡的感染誘導(dǎo)抑制作用的機(jī)理。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，BCL2A1的正調(diào)節(jié)，它是有抗細(xì)胞凋亡活性BCL2凋亡基因家族的成員。第二個(gè)發(fā)現(xiàn)是，在線粒體里羊種布魯氏菌的感染負(fù)調(diào)節(jié)了基因的表達(dá)，這個(gè)基因的表達(dá)在減少細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。牛種布魯氏菌突變體缺乏完整的LPS O鏈多聚糖不能抑制細(xì)胞凋亡，而且事實(shí)上卻誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性。這個(gè)影響作用在細(xì)胞上依靠的是T4SS，但是它也可能和O鏈多聚糖在抑制TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用相關(guān)[35～36]。

2.3 布魯氏菌在免疫應(yīng)答上的作用

布魯氏菌感染的免疫應(yīng)答特征在小鼠身上被廣泛的描述了。和人類身上的感染情況相同的是，布魯氏菌感染的鼠類的單核噬菌細(xì)胞系統(tǒng)和在缺乏抗生素處理的情況下，布魯氏菌能持續(xù)的存在數(shù)月而不引起嚴(yán)重的發(fā)病和死亡。在小鼠感染的早期，宿主的應(yīng)答類似于一個(gè)TH1的應(yīng)答，和通過T細(xì)胞和NK細(xì)胞的的IFN-γ的產(chǎn)生一樣。在小鼠身上，CD4+和CD8+T細(xì)胞有助于布魯氏菌感染的控制，這可能反映它們作為IFN-γ的來源的角色。這種早期的TH1的反應(yīng)是非常重要的。因?yàn)?，IFN-γ缺陷的小鼠，例如敲除IFN-γ的小鼠和缺乏IRF-1調(diào)節(jié)因子的小鼠，都不能夠控制小鼠全身的細(xì)菌感染而且也失敗于克服牛種布魯氏菌的感染。在體內(nèi)，布魯氏菌誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)比已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的例如沙門氏菌病的化膿的感染更加廣泛，它反映了布魯氏菌逃避固有免疫系統(tǒng)檢測的能力。小鼠身上早期免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄圖譜表明T4SS對于減少IFN-γ和其他IFN-γ的產(chǎn)生發(fā)揮了重要的作用。盡管和它們的同基因的野生型毒株一樣在脾臟中存在相同的數(shù)量，virB突變體失敗的引起任何炎性反應(yīng)。與布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)相關(guān)的促炎性表型，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和T4SS和其他病原體的III型分泌系統(tǒng)，包括肺炎軍團(tuán)菌的Dot/Icm T4SS、幽門螺桿菌的慢性萎縮性胃炎毒力島T4SS和沙門氏菌的毒力島（SPI-1）和SPI-2 T3SS，它們的活性都被細(xì)胞質(zhì)的先天免疫系統(tǒng)感應(yīng)器，包括Nlrc4，Nlrp3，Naip5，和Nod1檢測到。因此，可能布魯氏菌的VirB T4SS通過改變位置引起促炎性反應(yīng)，或者通過保守的細(xì)菌的配體或是通過細(xì)胞質(zhì)的固有免疫接受器來啟動(dòng)促炎性信號T4SS效應(yīng)器[37～39]。

除了誘導(dǎo)早期的TH1反應(yīng)，牛種布魯氏菌也誘導(dǎo)抗炎性細(xì)胞質(zhì)白介素10（IL-10）。IL-10能由CT淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)能抑制巨噬細(xì)胞抗布魯氏菌的抑菌活性，和IFN-γ的反抗的活性。B細(xì)胞可能是IL-10的重要來源，因?yàn)槿狈細(xì)胞的老鼠更可能限制牛種布魯氏菌的感染[40]。牛種布魯氏菌脯氨酸消旋酶（PrpA）已經(jīng)顯示了發(fā)揮B細(xì)胞引起絲狀分裂的活性和通過生脾細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-10分泌系統(tǒng)?？傊?，這些研究都表明了布魯氏菌阻礙有效免疫反應(yīng)的策略，它可能是誘導(dǎo)產(chǎn)生B細(xì)胞的IL-10的擴(kuò)張。

雖然小鼠模型已經(jīng)提供了關(guān)于布魯氏菌病引起的免疫反應(yīng)的重要觀點(diǎn)，對小鼠的巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞的研究都得出了和人類相似的結(jié)果，但是并不是所有人類對布魯氏菌免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素都能在小鼠體內(nèi)被研究。布魯氏菌病病人和人類初級細(xì)胞的研究已經(jīng)證實(shí)了人類特異的宿主反應(yīng)的因素。例如，鑒于鼠科動(dòng)物NK細(xì)胞對于控制牛種布魯氏菌感染并不十分重要，人類的NK細(xì)胞可以調(diào)節(jié)依賴性接觸的豬種感染的巨噬細(xì)胞[41]。而且，人類特異的T細(xì)胞（Vγ9Vδ2）能殺死感染豬種的巨噬細(xì)胞通過釋放抗微生物的多肽類。因此，關(guān)于研究人類和鼠科系統(tǒng)的研究將被證明是有價(jià)值的，同時(shí)也是對于闡明人類布病對于人類免疫反應(yīng)的編排的補(bǔ)充[42]。在人類慢性感染的過程中，起初的TH1反應(yīng)衰退了，獲得了TH2反應(yīng)的特征，例如IL-13產(chǎn)生的T細(xì)胞的增加。慢性布魯氏菌病病人不能表現(xiàn)一般免疫抑制的特征，因?yàn)樗麄兊募?xì)胞仍然能對引起絲狀分裂物的刺激物引起反應(yīng)。潛在的對于免疫反應(yīng)的TH極化的機(jī)理是很難理解的，對于推測在慢性感染過程中固有免疫刺激的低水平是非常誘人的，它可能是不能對維持一個(gè)有效免疫反應(yīng)提供信號。

3 宿主的向外傳播和排出布魯氏菌

布魯氏菌能被傳播出去，在帶菌者中或者通過垂直傳播、通過污染的牛奶、胎盤或者是水平傳播，通過生殖器接觸、與其他發(fā)生流產(chǎn)的動(dòng)物的接觸傳播。雖然牛種布魯氏菌通過流產(chǎn)胎兒傳播是牛布病的特征，但是從宿主中排出而且傳播可能是我們在分子水平上了解的最少的階段。在妊娠過程中，對于來自母體的抗原在正在發(fā)育的胎兒身上產(chǎn)生免疫耐受，導(dǎo)致在感染部位和全身的免疫反應(yīng)，同時(shí)也轉(zhuǎn)移免疫反應(yīng)朝著Th2的方向偏離[43]。因?yàn)門h1的反應(yīng)可以控制布魯氏菌的感染，這個(gè)轉(zhuǎn)移也提供了一個(gè)免疫環(huán)境，它對于控制細(xì)胞內(nèi)的病原菌布魯氏菌是不利的，而且它也允許細(xì)菌在全身各部位持續(xù)存在，例如從脾和淋巴結(jié)進(jìn)入血液循環(huán)，同時(shí)也在妊娠的子宮內(nèi)增殖。牛種布魯氏菌在胚胎滋養(yǎng)層中復(fù)制，這個(gè)部位和巨噬細(xì)胞相似，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這和ER相關(guān)[44]。增殖能導(dǎo)致最終發(fā)生胎盤炎和后期妊娠的流產(chǎn)。牛胎盤的移植模型已經(jīng)被用于對宿主對牛種布魯氏菌感染的研究中，而且它也可能是一個(gè)分析細(xì)菌感染的有用的工具，它要求的是定位和在胎盤滋養(yǎng)層中的復(fù)制。

布魯氏菌對于妊娠胎盤的趨性可能是赤蘚糖醇（首選碳源）的存在，因?yàn)椴剪斒暇昧姿嵛焯嵌皇翘墙徒馔緩饺テ茐奶荚?，它可以獲得比通過糖酵解途徑獲得碳源的兩倍的能量。然而，在赤蘚糖醇利用、妊娠胎盤的趨性和流產(chǎn)的因果關(guān)系還沒有明確的建立。在這個(gè)方面，能引起狗流產(chǎn)的犬種布魯氏菌不能利用赤蘚糖醇作為碳源，所以如果牛種布魯氏菌和羊種布魯氏菌利用赤蘚糖醇也在胎盤定位和流產(chǎn)方面起到重要作用，它可能和其他新陳代謝旁路途經(jīng)和引起流產(chǎn)的各種型布魯氏菌的毒力機(jī)制起到增效作用[45]。

4 展望

布魯氏菌逃避和推翻固有免疫反應(yīng)的關(guān)鍵策略是持續(xù)的感染。大量的研究結(jié)果闡明，布魯氏菌調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的白細(xì)胞聚集到細(xì)胞內(nèi)生存，同樣也理解了逃避固有免疫系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)。但是我們對于布病致病機(jī)制的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，隨著多株布魯氏菌全基因組序列的測序完成，未來必將有很多高通量的新的研究方法應(yīng)用于布魯氏菌和宿主相互作用關(guān)系。例如：基于RNA-Seq技術(shù)研究布魯氏菌及宿主的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)，這項(xiàng)研究必將進(jìn)一步加深我們對目的靶基因功能作用及布魯氏菌致病機(jī)理關(guān)系的理解。

略）