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    胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

    2013-01-25 04:25:30金慧慧趙永聚
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2013年10期
    關(guān)鍵詞:動(dòng)物模型母羊胎盤

    金慧慧,趙永聚

    (西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶市草食動(dòng)物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心,重慶 400716)

    胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth restriction,IUGR)是指出生體重低于同孕齡正常胎兒體重的第10百分位數(shù)[1],是胎兒在子宮內(nèi)的生長發(fā)育受到阻礙而引起的胎兒出生體重下降的現(xiàn)象,是多胎妊娠的常見并發(fā)征。在我國,IUGR發(fā)生率為2.75%~15.53%,圍產(chǎn)兒死亡率較正常體重新生兒高4~6倍,存活者出生后生長發(fā)育遲緩。IUGR胎兒在子宮內(nèi)會(huì)出現(xiàn)器官生長發(fā)育不對(duì)稱、缺氧、酸血癥、宮內(nèi)死亡等現(xiàn)象,出生后出現(xiàn)代謝紊亂、腦室出血等癥狀,甚至與成年期的心血管病、糖尿病、肥胖等的發(fā)生有一定的關(guān)系[2]。

    IUGR是圍產(chǎn)期的主要并發(fā)癥之一,病因多而復(fù)雜,胎盤功能紊亂[3](placental insufficiency)是最易引起IUGR的原因之一。有實(shí)驗(yàn)表明:在人類和動(dòng)物的妊娠后期,影響胎兒生長發(fā)育的主要因素是胎盤向胎兒供應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)和氧以及胎盤血流灌注量。趙惠[4]的研究顯示:不明原因IUGR患者胎盤系數(shù)較對(duì)照組明顯增加(0.179±0.036 VS 0.148±0.019),胎盤質(zhì)量明顯降低(420±68 g VS 542±91 g)。2006年,Wu等[2]認(rèn)為 IUGR 不僅會(huì)降低動(dòng)物出生后的生長速度和飼料利用率,而且對(duì)動(dòng)物生長后期的體組成、肉品質(zhì)甚至整個(gè)繁育階段的生育力造成負(fù)面影響。IUGR引起越來越多的動(dòng)物繁殖工作者和生產(chǎn)實(shí)踐者的關(guān)注。同時(shí),建立與人類臨床病理特征相似的IUGR動(dòng)物模型以研究其發(fā)病機(jī)制及尋求有效的治療方法就顯得尤為重要。

    1 IUGR的臨床診斷與治療

    診斷IUGR的一般臨床方法有腹臍靜脈穿刺、羊膜腔穿刺、多普勒血流測定、超聲生物計(jì)量學(xué)檢測等。多數(shù)研究以胎兒體重作為惟一預(yù)測IUGR的標(biāo)準(zhǔn),但動(dòng)態(tài)監(jiān)測胎兒生長情況對(duì)預(yù)后的判斷卻更具有價(jià)值,并且把母體體重、產(chǎn)次及胎兒性別等也納入診斷參考因素。

    羊水量是評(píng)估胎兒宮內(nèi)安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。羊水量過少,則提示IUGR及死胎發(fā)生率增加。77%~83%IUGR孕婦的超聲檢查結(jié)果可見羊水量過少。子宮動(dòng)脈多普勒血流測定[5]是在早孕和中孕期篩查早發(fā)型IUGR的較好方法,靈敏度分別為25%和75%,假陽性率為5% ~10%。

    目前,超聲作為一種無創(chuàng)性的檢查方法,是預(yù)測IUGR的一種主要手段。超聲估計(jì)胎重(estimated fetalweight,EFW)、頭 圍 (head circumference,HC)、腹圍(abdominal circumference,AC)或其他胎兒發(fā)育指數(shù)的生物計(jì)量學(xué)指標(biāo)[6],被廣泛應(yīng)用于IUGR的臨床診斷。超聲檢測指標(biāo)EFW或AC值小于同孕齡正常胎兒的第10個(gè)百分位,則提示可能是 IUGR[7]。其中,超聲 AC測量是 EFW最準(zhǔn)確的方法,靈敏度為72.9% ~94.5%,特異度為50.6% ~83.8%。

    賀晶[8]提出了糖皮質(zhì)激素治療、肝素和乙酸水楊酸治療、激素補(bǔ)充、抗氧化劑治療、臥床休息、高壓氧治療、胎兒宮內(nèi)感染治療等治療IUGR的方法。有文獻(xiàn)[5]報(bào)道指出:羊膜腔內(nèi)輸注氨基酸、靜脈營養(yǎng)、硫酸鎂治療等方法也可達(dá)到治療IUGR的目的。2012年,Pandey Kiran等[9]的研究顯示:57.8% 的IUGR孕婦患有高同型半胱氨酸血癥,服用葉酸、維生素B6和維生素B12能有效的改善臨床癥狀,并成功的提出了IUGR維生素治療法。

    2 模型動(dòng)物的選擇

    目前,IUGR的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有大鼠、小鼠、豚鼠、兔等嚙齒類動(dòng)物和羊、豬、牛等家養(yǎng)動(dòng)物。理想的IUGR動(dòng)物模型首先要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要與人具有較好的相似性,解剖和生理學(xué)特點(diǎn)盡可能與人類相似,可重復(fù)性好,便于檢測評(píng)價(jià),經(jīng)濟(jì)可行。

    大鼠數(shù)量多,繁殖快,適應(yīng)力強(qiáng),懷孕時(shí)間短,造模成本較低,是科學(xué)實(shí)驗(yàn)最常用的動(dòng)物。但是嚙齒動(dòng)物體型較小,生理結(jié)構(gòu)和胎兒發(fā)育進(jìn)程與人類有著較大的差異,當(dāng)涉及胎盤功能不足引起的IUGR和胎盤形態(tài)學(xué)的研究時(shí),該類模型就不恰當(dāng)。2011年,F(xiàn)ung等人[10]用 U-46619血栓素 A(2)注射小鼠誘導(dǎo)發(fā)生IUGR,并引起母鼠產(chǎn)生妊娠高血壓病。同年,Novitskaya T等人[11]用 Cited1基因敲除的小鼠制造妊娠后期胎盤功能紊亂的IUGR模型,并探討了Cited1基因在胎盤和胎兒的發(fā)育中的作用。

    大鼠IUGR模型的研究利用最早,使用也最廣泛,但是以羊、豬為IUGR模型比大鼠更有優(yōu)勢。母羊和羊羔在各生理階段的發(fā)育和解剖學(xué)特點(diǎn)與人相似,其個(gè)體大小適宜于手術(shù)、解剖、采樣、采血等實(shí)驗(yàn)操作,所獲得的模型與人的相似。有些品種具有產(chǎn)羔數(shù)多、性成熟早的特點(diǎn),容易獲得IUGR個(gè)體和便于建立對(duì)照組。在我國,羔羊易人工飼養(yǎng),飼料來源廣泛,試驗(yàn)成本較低。但是制模所需要的時(shí)間較長,過程也比較繁瑣。

    2003,陳才勇[12]認(rèn)為當(dāng)需要的IUGR仔豬樣本不大時(shí),通常直接選擇自然條件下產(chǎn)生的弱仔,該方法隨機(jī)性強(qiáng)。另一種方法就是通過妊娠母豬限飼、子宮動(dòng)脈結(jié)扎、被動(dòng)吸煙、降低空氣氧含量等方法來獲得IUGR樣本。

    3 IUGR動(dòng)物模型

    3.1 自然選擇法

    自然選擇法是直接選用自然情況下產(chǎn)生的弱仔,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來確定IUGR胎仔。在孕齡相同的胎仔群體中,初生體重最輕的、低于平均體重10%的胎仔個(gè)體認(rèn)為是 IUGR仔。1982年,Royston[13]建立了確定IUGR仔豬的另一種方法,即把一窩仔豬按初生重從小到大排列在正態(tài)分布紙上繪制一條曲線,橫坐標(biāo)為仔豬的初生重,縱坐標(biāo)為仔豬按體重排名位次與該窩產(chǎn)活仔數(shù)的比值。如果所有仔豬的體重分布正常,制成的圖應(yīng)為一條直線;如果某些仔豬過小或過大,它們的體重會(huì)偏離直線,體重低于整個(gè)直線的仔豬就是IUGR仔豬。

    鑒于絕大多數(shù)IUGR胎兒都是在自然條件下產(chǎn)生的,沒有受到手術(shù)、藥物或是限食的作用,減少動(dòng)物受到的傷害,增加了胎仔的出生率和存活率,所以自然狀態(tài)下的IUGR胎仔更具有代表性。這種獲得IUGR幼子的方法不僅適用于綿羊、豬、牛等家養(yǎng)動(dòng)物,也適合于小鼠、大鼠等嚙齒動(dòng)物。

    3.2 手術(shù)摘除子宮肉阜模型

    子宮肉阜是母體-胎兒界面唯一能與胎兒細(xì)胞直接接觸的母體免疫系統(tǒng)。因此在摘除子宮肉阜之后,胎盤細(xì)胞的數(shù)目會(huì)下降,胎盤的生長和功能受到限制,并且阻礙了胎盤向胎兒氧和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。1964年,G.Alexander[14]的研究就表明出生體重和完整的子葉、胎兒子葉的重量是呈正相關(guān)的。胎兒的子葉數(shù)會(huì)隨著羊的品種,母羊的配種,羊羔大小、產(chǎn)次、性別,外界環(huán)境和肉阜數(shù)目的變化而變化。2001年,Phillips等[15]通過手術(shù)去除妊娠期母羊子宮內(nèi)膜的肉阜來限制胎盤的發(fā)育和功能,從而阻礙胚胎的正常生長發(fā)育。2007年,JL Morrison等[16]的研究表明:在交配期前手術(shù)摘除大部分的子宮肉阜可以誘導(dǎo)產(chǎn)生胎兒生長受限;出生后的胎兒出現(xiàn)長期缺氧、生長遲緩等現(xiàn)象,血漿中皮質(zhì)醇濃度上升、心臟中單核心肌細(xì)胞比例上升等異?,F(xiàn)象。

    在無菌的環(huán)境下麻醉母羊,打開母羊子宮,切除子葉表面的絨毛膜。盡可能地切掉肉蒂到子葉之間的肉阜,吸干子葉并計(jì)數(shù)、稱重。雙胞胎的左、右子宮角中的子葉則要分別處理。術(shù)后觀察母羊的恢復(fù)情況,10 周后母羊進(jìn)入交配期[14-17]。

    綿羊的生理結(jié)構(gòu)和胎兒的生長發(fā)育與人相似,能進(jìn)行各種手術(shù)和植入導(dǎo)管進(jìn)行檢測,可以研究子宮內(nèi)胎兒對(duì)短期或長期的胎盤功能不全的功能性應(yīng)答。切除大部分的子宮肉阜破壞了胎盤的正常結(jié)構(gòu)和功能,會(huì)導(dǎo)致母羊的懷孕率大大降低,增大實(shí)驗(yàn)難度;并且母羊經(jīng)過手術(shù)之后要修養(yǎng)4 d以上,增加實(shí)驗(yàn)成本。嚙齒動(dòng)物無法進(jìn)行這樣的手術(shù),因?yàn)樾∈蠛痛笫蟮葒X動(dòng)物的個(gè)體較小,出生的幼子相對(duì)不成熟。

    3.3 被動(dòng)吸煙模型

    吸煙能產(chǎn)生多種有毒物質(zhì),如氰化物、CO、尼古丁等,它們通過降低胎盤血液灌注量及血液帶氧能力,降低血氧飽和度,影響眙盤對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和維生素的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而影響胎盤和胎兒的發(fā)育,導(dǎo)致IUGR的發(fā)生。

    張秀泉等[18]用被動(dòng)吸煙法創(chuàng)制了IUGR兔模型,發(fā)現(xiàn)孕兔母體及其胎仔血漿游離氨基酸的濃度均明顯下降。之后,用被動(dòng)吸煙法制造了IUGR大鼠模型,成功率可達(dá)48.33%。尤昭玲等[19]在上述制模的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),在被動(dòng)吸煙的同時(shí)給大鼠飲酒,2 mL/次/只,成功制作了IUGR大鼠模型,成功率高達(dá)51.0%??轮居拢?0]比較了被動(dòng)吸煙法、更生霉素腹腔注射法、子宮動(dòng)脈結(jié)扎法這三種制模方法,發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙法獲取存活的IUGR仔鼠數(shù)量最多,效果最好,更生霉素腹腔注射法次之,子宮動(dòng)脈結(jié)扎法效果最差;IUGR的發(fā)生率分別為61.6% 、42.2% 、27.8% 。

    將大鼠置于室溫23~25℃、濕度55% ±5%、通風(fēng)清潔的環(huán)境,飼道固定,給水充分。雌鼠陰道涂片,將動(dòng)情期雌鼠與雄鼠合籠過夜,次晨取陰道生理鹽水沖洗液鏡檢,發(fā)現(xiàn)精子者為妊娠第1天。確定妊娠的第2天開始進(jìn)行被動(dòng)吸煙制模,方法為[20]:將孕鼠連籠置于特制的半封閉木箱中,側(cè)面相對(duì)各留一通氣口,將香煙點(diǎn)燃置箱中,每天分別于9 am,12 am,2 pm,4 pm 進(jìn)行一次,前10 d每次燃1支香煙,后10 d每次2支,共20 d,后待其自然分娩。孕鼠分娩后,即稱量鼠仔體重,部分仔鼠進(jìn)行解剖稱量臟重。

    被動(dòng)吸煙法較溫和而持久,效果較好。但是妊娠初期就進(jìn)行吸煙制模,會(huì)影響大鼠孕卵著床,降低妊娠成功率,從而影響制模效果。在制模時(shí),動(dòng)物需要呆在一個(gè)特制的半封閉的控制室內(nèi),而綿羊活動(dòng)所需要的空間大,吸煙的量也大,這就造成制模的不便,也造成成本加大,因此該模型不適用于綿羊。

    3.4 子宮動(dòng)脈結(jié)扎法

    子宮動(dòng)脈結(jié)扎法是通過減少子宮胎盤血液灌注,直接減少胎盤血液和氧的供應(yīng)量,導(dǎo)致胎兒慢性缺血缺氧,最終形成IUGR,這與人類子宮胎盤灌注不足、血液循環(huán)異常導(dǎo)致IUGR的機(jī)制十分相似。

    從1964年以后,子宮動(dòng)脈結(jié)扎法開始被廣泛推廣應(yīng)用,這種方法也稱為Wigglesworth法。但是此種方法也存在著操作復(fù)雜繁瑣、影響急劇、較完全的血液供應(yīng)中斷常使相應(yīng)部位胎兒死于宮內(nèi)而導(dǎo)致流產(chǎn)等缺點(diǎn)。Terry H等[21-22]采取的部分結(jié)扎方法也存在著結(jié)扎過緊則鋼絲抽出后血流量大大減少,宮內(nèi)死胎率很高,結(jié)扎過松則IUGR發(fā)生率較低的問題。因此,潘石蕾等[23]采用雙側(cè)子宮動(dòng)靜脈部分結(jié)扎法,建立了良好的IUGR動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量為(3.32±0.54)g,IUGR發(fā)生率為33.33%,胎鼠死亡率低,為4.94%;對(duì)照組大鼠體質(zhì)量為(4.55±0.76)g,IUGR發(fā)生率為1.14%。此方法簡化了手術(shù)操作,縮短了手術(shù)及麻醉時(shí)間,還減少了因子宮暴露于腹腔外時(shí)間過長對(duì)胎兒所造成的影響。

    參照Terry Hagashi等的Wigglesworth改良法,在妊娠108~119 d時(shí)進(jìn)行手術(shù)。麻醉后母羊取平臥位,固定四肢于手術(shù)臺(tái),暴露腹部皮膚,取下腹正中切口逐層進(jìn)腹,暴露子宮,以溫生理鹽水紗布保護(hù)子宮,尋找到子宮臍動(dòng)脈,在結(jié)扎處并行置一鋼絲,一并結(jié)扎子宮動(dòng)脈和鋼絲,然后將鋼絲輕輕抽出,遠(yuǎn)端動(dòng)脈即可見血液充盈,但充盈程度不及近端。結(jié)扎單側(cè)子宮動(dòng)脈后關(guān)閉腹腔,這樣就會(huì)在胎盤上造成一個(gè)局部的梗塞,并使胎盤的運(yùn)輸能力受到限制。大鼠子宮動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)間宜選在妊娠17 d,在妊娠14 d、15 d結(jié)扎,胎仔死亡率、流產(chǎn)率都會(huì)增加;子宮動(dòng)脈不能完全結(jié)扎,否則胎仔死亡率明顯增高(達(dá)60~80%)。

    毛萌等人[24]認(rèn)為動(dòng)脈結(jié)扎法胎仔死亡率高,建立了短暫鉗夾子宮卵巢動(dòng)脈建立大鼠IUGR模型。鉗夾組于孕17 d進(jìn)行雙側(cè)子宮及卵巢動(dòng)脈鉗夾術(shù)30 min,假手術(shù)組同期行剖腹、關(guān)腹術(shù),但不鉗夾子宮及卵巢動(dòng)脈。結(jié)果發(fā)現(xiàn):鉗夾組胎仔、胎盤、肝臟重量明顯低于假手術(shù)組(P<0.001),腦重亦低于假手術(shù)組(P<0.05),胎盤結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)明顯異常。

    3.5 營養(yǎng)不良模型

    母體妊娠期間,減少母體的攝食量會(huì)減少母羊體重,從而限制了供給胎兒的營養(yǎng)物質(zhì),子宮和臍動(dòng)脈的血流量減少,限制了胎盤的生長和功能,最終形成 IUGR[25]。

    低蛋白飲食和低能量飲食是建立IUGR營養(yǎng)不良動(dòng)物模型的常用方法,以采用低蛋白質(zhì)飲食法居多。2005年,劉彥慧等[26]用限食和飲酒的方法制得混合型IUGR大鼠模型。實(shí)驗(yàn)組孕鼠從妊娠第1d起直至妊娠結(jié)束,每日均給予對(duì)照組飼料的40%,從妊娠第7天起給孕鼠每日酒精灌胃(0.9 mL/100g),并記錄孕鼠每日體重的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)組胎鼠體重、胎盤重、肝重、腦重、身長、尾長明顯低于對(duì)照組,IUGR發(fā)病率顯著高于對(duì)照組(65.35%VS 2.48%)。2010 年,Rezzoug,F(xiàn) 等人[27]用限食和被動(dòng)吸煙的方法成功誘導(dǎo)不對(duì)稱型IUGR。

    給母體喂食缺乏維生素B1的食物[28],同時(shí)皮下注射維生素B1拮抗劑抗硫胺素可使妊娠動(dòng)物出現(xiàn)選擇性營養(yǎng)不良,從而表現(xiàn)出典型的維生素B1缺乏癥狀,導(dǎo)致胎兒發(fā)生IUGR。但是饑餓法難于掌握饑餓程度,選擇性低蛋白法給實(shí)驗(yàn)配制飼料帶來很多不便,營養(yǎng)水平難以控制;同時(shí),不同的低營養(yǎng)水平、不同的限飼時(shí)間對(duì)IUGR的發(fā)生也有很大的影響。

    3.6 其他制模方法

    更生霉素[29-30]能與 DNA 形成化合物,選擇性抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成,抑制細(xì)胞的增殖。因此,注射更生霉素將直接影響胎兒和胎盤中細(xì)胞的生長發(fā)育,引起胎盤功能不足,減少對(duì)胎兒營養(yǎng)物質(zhì)的供給,導(dǎo)致IUGR的發(fā)生。該方法簡單方便,僅需一次注射就可以完成,但是更生霉素毒性較大,有一定的副作用。

    此外,研究人員還嘗試使用了熱應(yīng)激母羊模型、胎盤塞栓法、缺氧法等模型方法,并受到科研人員的關(guān)注。每一個(gè) IUGR動(dòng)物模型都能引起人IUGR的臨床癥狀,也都有特定的優(yōu)勢和劣勢,還需要繼續(xù)研究并取得突破。

    4 IUGR模型的應(yīng)用

    IUGR動(dòng)物模型在臨床上和動(dòng)物繁殖育種方面都有著積極地作用。在臨床上,IUGR動(dòng)物模型的建立對(duì)降低低出生體重兒出生和患病有重大意義,對(duì)判斷胎兒生長遲緩是否存在以及嚴(yán)重程度有巨大的幫助。在此模型的基礎(chǔ)上,采用羊膜腔穿刺、多普勒血流測定、超聲生物計(jì)量學(xué)檢測等方法,使醫(yī)生了解胎兒、胎盤血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)及胎兒宮內(nèi)發(fā)育情況,有利于采用適當(dāng)?shù)闹委熀皖A(yù)測不良妊娠的結(jié)局,提高圍產(chǎn)學(xué)質(zhì)量。

    IUGR對(duì)新生仔豬的適應(yīng)能力和成活、產(chǎn)后生長、飼料利用率、體組成、肉質(zhì)和運(yùn)動(dòng)性能等均存在長期的負(fù)面影響。通過對(duì)胎兒發(fā)育過程和模型的認(rèn)識(shí),探索IUGR發(fā)生機(jī)制,在發(fā)育關(guān)鍵階段就開始采取提高家畜產(chǎn)后生長發(fā)育的措施,從而減少IUGR的發(fā)生。尤昭玲等[31]以孕晚期大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用被動(dòng)吸煙加飲酒的方法建立IUGR模型,探討血管活性物質(zhì),如一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(endothelin,ET)、血管緊張素(angiotensin,Ang)等在大鼠IUGR發(fā)病中的作用。

    5 結(jié)束語

    隨著營養(yǎng)學(xué)、繁殖生理學(xué)、血管生物學(xué)等多學(xué)科交叉的創(chuàng)新研究的發(fā)展,對(duì)設(shè)計(jì)新的動(dòng)物模型和家畜管理方案起著關(guān)鍵作用,這將會(huì)提高建立動(dòng)物模型的成功率和改善動(dòng)物健康狀況。但是,考慮到物種間存在著許多生物學(xué)因素的差異,我們需謹(jǐn)慎選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和造模方法,從而避免對(duì)人類IUGR的實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生誤導(dǎo)。

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