Cullin蛋白在生殖系統(tǒng)中的研究進(jìn)展

田 燁，趙 涵，陳子江

山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 國(guó)家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心生殖內(nèi)分泌教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250021

泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式，E3泛素連接酶決定了泛素化過程的特異性。高等真核生物體內(nèi)存在1000多種E3泛素連接酶，其中Cullin-Ring類E3連接酶 (cullin-ring-based E3-ligases，CRLs)占主體地位［1］。Cullin蛋白作為支架參與CRLs蛋白復(fù)合體的構(gòu)成，在DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、腫瘤抑制、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

CRLs家族成員是以蛋白復(fù)合體形式存在，包括小RING蛋白 (ROC1、ROC2)、Cullin蛋白、linker(如SKP1、ElonginB/C、DDB1等)和底物識(shí)別亞單位 (substrate recognize subunit，SRS)，如:F-box、DCAF等。Cullin蛋白發(fā)揮著支架作用，其本身不含有RING結(jié)構(gòu)域，而是在C端結(jié)合1個(gè)含有RING的小蛋白R(shí)OC1/ROC2，在人體內(nèi)共存在7種Cullin蛋白，CUL-1、CUL-2、CUL-3、CUL-4A、 CUL-4B、CUL-5、CUL-7［2］。與其他E3類泛素連接酶不同，CRLs家族成員并不和底物直接結(jié)合，而是通過一系列SRS特異性結(jié)合底物，從而使泛素從E2結(jié)合酶轉(zhuǎn)移到底物上。其中，已被解析結(jié)構(gòu)的CRL主要有CUL-1參與的SCF復(fù)合物 (F-box/SKP1/CUL-1/ROC)的晶體結(jié)構(gòu)、CUL-4A參與的CRL-4s復(fù)合物 (DCAF/DDB1/CUL-4A/ROC)的晶體結(jié)構(gòu)［3］，因此兩者在結(jié)構(gòu)及功能學(xué)上的研究較為深入。

CUL-1與SCF復(fù)合物

CUL-1可與Skp1、ROC、F-box共同構(gòu)成SCF復(fù)合物，SCF是研究最多的E3連接酶，因此對(duì)SCF復(fù)合物中除CUL-1之外其他組分—F-box與生殖系統(tǒng)疾病的關(guān)系略作介紹。F-box發(fā)揮著特異性識(shí)別底物的作用，目前已鑒定的人體內(nèi)F-box有70余種，在生殖系統(tǒng)中與配子的發(fā)生［4］、減數(shù)分裂［5］、卵子的儲(chǔ)備［6］有關(guān)。

CUL-1與胚胎發(fā)育 CUL-1是SCF復(fù)合物中的支架蛋白，和胚胎的早期發(fā)育密切相關(guān)。Pennetier等［7］發(fā)現(xiàn)和腸、肺、骨骼肌等的體細(xì)胞相比，在牛的卵母細(xì)胞中CUL-1有明顯的表達(dá)優(yōu)勢(shì)，這種空間表達(dá)特異性提示CUL-1可能在配子的發(fā)生、受精及早期胚胎發(fā)育中有重要作用。另外，在CUL-1基因敲除小鼠在胚胎第6.5天原腸胚形成之前胚胎發(fā)育停止，CUL-1－/－鼠囊胚體外培養(yǎng)時(shí)可觀察到其增殖能力下降，這說明CUL-1在哺乳動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用［8-9］。

F-box與生殖系統(tǒng)疾病 在SCF復(fù)合物中，Skp2是研究較多的一類F-box，可作用于下游的p27，在很多婦科腫瘤如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中均可檢測(cè)到p27表達(dá)的下調(diào)及Skp2表達(dá)的上調(diào)，而且二者表達(dá)水平的改變和腫瘤的生物學(xué)行為 (浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移)、腫瘤分級(jí)以及患者的預(yù)后等相關(guān)［10-12］。Skp2和卵巢早衰 (premature ovary failure，POF)可能相關(guān)，POF是指女性患者40歲之前提前絕經(jīng)，內(nèi)分泌學(xué)特點(diǎn)是雌激素水平低下而促性腺激素水平升高。有研究發(fā)現(xiàn)，Skp2基因敲除的小鼠胚胎期卵巢細(xì)胞凋亡增加，有功能的配子儲(chǔ)備減少，從而導(dǎo)致性成熟后卵巢早衰出現(xiàn)［6］，但目前還未有 POF患者和Skp2相關(guān)的臨床證據(jù)。

綜上，從結(jié)構(gòu)上來講，CUL-1是SCF復(fù)合體不可或缺的組成部分;從功能上講，CUL-1和胚胎的早期發(fā)育直接相關(guān)，而SCF復(fù)合體中F-box(Skp2)與宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等婦科腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，與目前病因并不明確的可表現(xiàn)為婦科內(nèi)分泌異常的疾病卵巢早衰可能有一定相關(guān)性，為明確其病因提供了新的線索，而CUL-1在生殖系統(tǒng)疾病中的功能有待進(jìn)一步研究。

CUL-2和CUL-5

減數(shù)分裂與卵的產(chǎn)生 CUL-2和CUL-5在生殖系統(tǒng)中的功能研究多數(shù)來自模式生物—秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅。在秀麗隱桿線蟲中，CUL-2和減數(shù)分裂及胚胎的極性相關(guān)［13］，CUL-2失活可導(dǎo)致 CyclinB1降解異常，致使減數(shù)分裂停滯在Ⅱ期中期;此外，還可觀察到胚胎極性的逆轉(zhuǎn)。既往研究認(rèn)為，Rbx2-CUL-5 based E3泛素連接酶復(fù)合體中CUL-5或Rbx-2均不是生長(zhǎng)發(fā)育所必須的。而隨后對(duì)CUL-5功能的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CUL-5和CUL-2之間有復(fù)雜的相互關(guān)系，野生型線蟲可產(chǎn)生約300個(gè)卵，CUL-5完全敲除的線蟲卵的產(chǎn)生不受影響，CUL-2完全敲除后僅產(chǎn)生約50個(gè)卵;而CUL-2完全敲除后用RNAi部分干擾掉CUL-5或者Rbx-2后線蟲表現(xiàn)為完全不育，但CUL-5和CUL-2之間的相互作用的具體機(jī)制尚不清楚［14］。對(duì)于黑腹果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，CUL-2、CUL-5與卵巢的發(fā)育有關(guān)，CUL-2在所有的生殖系細(xì)胞中廣泛表達(dá)，CUL-2缺失后表現(xiàn)為多種發(fā)育缺陷主要是生殖細(xì)胞的減少和滋養(yǎng)細(xì)胞的變性，而CUL-5缺失后也觀察到了相似的表型［15］。目前還未有CUL-2或CUL-5在人卵發(fā)生和成熟中功能的報(bào)道，或許人類卵子異常導(dǎo)致的不孕患者中可能存在CUL-2或CUL-5基因表達(dá)的異常。

CUL-5與卵巢異常囊樣表型 成熟的果蠅卵母細(xì)胞源于被稱為卵室的前體結(jié)構(gòu)，每個(gè)卵室含有16個(gè)相互連接的包囊細(xì)胞，其外由卵泡上皮包被可形成包囊。僅1個(gè)包囊細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂并發(fā)育為卵細(xì)胞，而另外15個(gè)變?yōu)樽甜B(yǎng)細(xì)胞［16］。當(dāng)CUL-5發(fā)生基因突變時(shí)，卵室表現(xiàn)為異常增大的囊樣結(jié)構(gòu)，原因是生殖細(xì)胞的過度增殖和外面包被的卵巢上皮細(xì)胞分隔形成異常。卵室中的生殖細(xì)胞均多于16個(gè)，可達(dá)幾十個(gè)。正常情況下，卵巢上皮細(xì)胞僅包被1個(gè)包囊細(xì)胞形成1個(gè)包囊，而CUL-5突變后，卵巢上皮細(xì)胞無法正常遷移至兩個(gè)包囊之間，導(dǎo)致出現(xiàn)多個(gè)包囊細(xì)胞被包被在同一層上皮內(nèi)［17］。在人類中，多囊卵巢綜合征 (polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者表現(xiàn)為卵巢多囊樣外觀，其多囊形成的機(jī)制仍未完全闡明，雖然人和動(dòng)物之間的生理結(jié)構(gòu)、疾病譜和其相應(yīng)的病理生理過程都有很大差異，但來源于模式生物的研究結(jié)果具有一定的提示作用，將來或許有CRLs家族與PCOS發(fā)生發(fā)展的研究被報(bào)道。

CUL-3

對(duì)生殖系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，CUL-3與精子發(fā)生、雄性不育密切相關(guān)。在小鼠中，CUL-3可在小鼠多種組織中表達(dá)，但主要分布于睪丸［18］，提示CUL-3的表達(dá)有一定的空間特異性。原位雜交在小鼠精子發(fā)育的各個(gè)階段均檢測(cè)到CUL-3 mRNA的表達(dá)，而僅在精子發(fā)生的后期有CUL-3蛋白表達(dá)。根據(jù)CUL-3的時(shí)間和空間表達(dá)譜，不難推斷CUL3-based E3類泛素酶與精子的晚期發(fā)生有關(guān)，其表達(dá)的異?？赡芤鹦坌圆挥６?，在果蠅中的研究［19］也支持這一推論，不管是昆蟲還是哺乳動(dòng)物，精子發(fā)生的最后階段都存在大量細(xì)胞質(zhì)的丟失，在果蠅體內(nèi)，這一過程需要凋亡蛋白caspase介導(dǎo)的細(xì)胞重構(gòu)，研究證實(shí)CUL-3復(fù)合物可通過激活caspase而在果蠅精子發(fā)生的后期發(fā)揮重要作用。

CUL-4

在人體內(nèi)主要包括兩種CUL-4基因，即CUL-4A和CUL-4B，CUL-4B突變可引起X連鎖智力低下［20］，表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲滯、軀干肥胖、巨頭畸形、共濟(jì)失調(diào)、震顫、性功能低下和男性乳房女性化，未有和人類疾病相關(guān)的CUL-4A的突變報(bào)道。目前在生殖系統(tǒng)中的研究表明，CUL-4主要是和雄性不育、性激素受體降解相關(guān)。

CUL-4A與雄性不育 CUL-4A敲除 (第4～8外顯子敲除)的雄性小鼠不育和精子發(fā)生受阻［21-22］，表現(xiàn)為精子數(shù)目減少、活動(dòng)力減弱及頂體產(chǎn)生異常。在精子發(fā)生過程中，CUL-4A-/-小鼠雙線期的精子中，晚期重組相關(guān)的分子MLH1異常降解，而使隨后的減數(shù)分裂Ⅱ期無法進(jìn)行。較為有趣的是，CUL-4A第4-8外顯子敲除的雌鼠可以懷孕并產(chǎn)下活仔，僅生育力輕度受損，可能原因?yàn)镃UL-4A敲除后，CUL-4B可代償其功能，而CUL-4B是X連鎖的，所以雌雄有差異。

CUL-4A與胚胎發(fā)育 CUL-4A敲除 (第1外顯子敲除)小鼠無存活的后代產(chǎn)生。性交后7.5 d(7.5 dpc)CUL-4A-/-胚胎已死亡，而4.5 dpc純合突變的囊胚泡可存活，推測(cè)CUL-4A-/-胚胎在4.5～7.5 dpc之間死亡，因此認(rèn)為CUL-4A與胚胎早期發(fā)育相關(guān)［23］。但是近年來此理論受到了質(zhì)疑，因?yàn)镃UL-4A基因敲除小鼠模型構(gòu)建方式的不同而出現(xiàn)的結(jié)果不同，敲除CUL-4A外顯子1后胚胎期致死，敲除外顯子17～19無表型，敲除外顯子4～8僅有小鼠胚胎纖維母細(xì)胞增殖有輕度上升。所以，CUL-4A在胚胎發(fā)育中的功能需要進(jìn)一步探究。

CUL-4B與雄激素不敏感 關(guān)于CUL-4B和激素關(guān)系的研究較少，近期研究發(fā)現(xiàn)CUL-4B可以和芳香烴受體 (aryl hydrocarbon receptor，AhR)組成新復(fù)合物，特異性識(shí)別底物雌激素受體和雄激素受體，并介導(dǎo)其降解［24］。雄激素受體的異常和多種雄激素不敏感的疾病發(fā)生相關(guān)［25］，如抗雄激素綜合征或者睪丸女性化，表現(xiàn)為女性外觀，但是無子宮和輸卵管，生殖腺為睪丸。Reifenstein綜合征也存在雄激素受體功能缺陷引起的雄激素不敏感現(xiàn)象，臨床表現(xiàn)為男性外觀、泌尿生殖發(fā)育異常、生殖器女性化。CUL-4B可介導(dǎo)雄激素受體的降解，推測(cè)和雄激素不敏感的臨床疾病可能有相關(guān)關(guān)系。

CUL-7

CUL-7在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和p53調(diào)節(jié)等方面的作用已有較為詳細(xì)的綜述［25］。CUL-7是較晚開始研究的E3泛素酶，其在生殖系統(tǒng)中的作用涉及較少。CUL-7的作用底物胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)是重要的胰島素信號(hào)通路分子，CUL-7缺乏可引起胰島素信號(hào)途徑異常而出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育缺陷［26］。此外，IRS-1絲氨酸的磷酸化等可引起信號(hào)向下游PI3K通路的傳導(dǎo)受阻，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島素抵抗與多種代謝紊亂的疾病的發(fā)生相關(guān)，如PCOS。PCOS是一類病因復(fù)雜的代謝紊亂疾病，臨床特點(diǎn)是高雄激素表現(xiàn)、卵巢多囊樣變、稀發(fā)排卵，可有糖代謝紊亂、脂代謝紊亂并可伴有心血管疾病、婦科腫瘤等長(zhǎng)期并發(fā)癥。胰島素抵抗是其最重要的病理生理機(jī)制之一，已有研究證實(shí)，IRS-1與PCOS中的胰島素抵抗相關(guān)［27-28］，因此推測(cè)CUL-7-IRS-1調(diào)節(jié)通路可能與PCOS相關(guān)，CUL-7基因突變或表觀遺傳學(xué)修飾的改變可能通過調(diào)節(jié)IRS-1蛋白功能從而影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。

總之，Culling蛋白是CRLs家族重要的組成部分，在生殖系統(tǒng)正常功能的維持中扮演重要角色，與婦科腫瘤、生殖與不育、婦科內(nèi)分泌疾病有一定的相關(guān)性，對(duì)于POF、PCOS等病因復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有一定提示作用。但目前多數(shù)研究?jī)H局限在動(dòng)物模型層面上，真正的臨床研究較少，很多源于模式動(dòng)物的結(jié)論和推論有待進(jìn)一步證實(shí)。相信隨著CRLs復(fù)合物結(jié)構(gòu)的闡明、新的作用底物的發(fā)現(xiàn)以及臨床研究的進(jìn)一步深入，其在生殖系統(tǒng)及其相關(guān)疾病中的作用也會(huì)逐漸明確。

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