二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體周圍骨組織中OPG和RANKL表達(dá)的影響

劉 宇 高 鶯 焦艷軍*

（山西醫(yī)科大學(xué)研究生院，山西 太原 030001）

二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體周圍骨組織中OPG和RANKL表達(dá)的影響

劉 宇 高 鶯 焦艷軍*

（山西醫(yī)科大學(xué)研究生院，山西 太原 030001）

目的 研究二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體模型骨組織中OPG和RANKL表達(dá)的影響，探討血糖變化對種植體周圍骨整合的意義。方法 將30只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常種植組（T0）、糖尿病種植組（T1）、糖尿病種植二甲雙胍干預(yù)組（T2）。糖尿病模型的建立采用高脂高糖飲食喂養(yǎng)以及腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素，種植組植入純鈦種植體，降糖藥物干預(yù)組每日二甲雙胍灌胃。每周觀察各組血糖水平，于12周處死大鼠，取脛骨，通過影像學(xué)方法觀察種植體周圍骨結(jié)合情況，并采用免疫組織化學(xué)方法檢測各組種植體周圍骨組織OPG和RANKL表達(dá)水平。結(jié)果 大鼠T1表達(dá)水平比T0和T2組都高，T0和T2組RANKL表達(dá)水平相當(dāng)；在RANKL/OPG比值的兩兩比較中，3組差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其值由高到低分別為T1組、T2組和T0組。結(jié)論 糖尿病對種植體周圍骨組織整合過程的影響可能是從升高RANKL表達(dá)水平和降低OPG表達(dá)水平兩方面來起作用的，而二甲雙胍可能通過改變OPG和RANKL的表達(dá)，促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合和骨形成。

二甲雙胍；糖尿病大鼠；種植體；OPG；RANKL

口腔種植是用外科手段將人工材料設(shè)計(jì)的種植體在頜骨內(nèi)植入，種植體支持義齒的上部結(jié)構(gòu)。人工種植義齒技術(shù)的日趨完善，能顯著地提高患者的咀嚼功能，且感覺舒適類似真牙，許多常規(guī)義齒難以解決的疑難臨床病例得到滿意療效。

糖尿病是一種能引起以高血糖為特征，具有遺傳傾向，且發(fā)病率較高的慢性疾病。有相當(dāng)多的糖尿病患者伴隨有不同程度的牙列缺損或牙列缺失，因糖尿病可通過多種病理機(jī)制影響著種植體周圍的骨整合，因此其被列為口腔種植手術(shù)的相對禁忌癥。但隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的糖尿病患者希望通過種植義齒達(dá)到改善生活質(zhì)量的要求，迫使我們在研究糖尿病患者口腔種植手術(shù)的適應(yīng)癥方面做出更多努力。本科題通過研究二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體模型骨組織中OPG和RANKL表達(dá)的影響，為臨床工作中糖尿病患者種植術(shù)前、術(shù)后合理用藥，從而達(dá)到良好骨整合目的提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

30只8周齡健康雄性成年SD大鼠，二級動物，體質(zhì)量240～260g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 器材及試劑

One Touch快速血糖儀（美國強(qiáng)生）、牙種植機(jī)（法國賽特里）、BX-51多功能生物顯微鏡（OLYMPUS公司）、BI-2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）、切片機(jī)（上海精密儀器有限責(zé)任公司）、螺紋柱狀純鈦種植體、種植器械（西安中邦器械有限公司）、鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）、檸檬酸、檸檬酸鈉、2%戊巴比妥鈉（天津市化學(xué)試劑三廠）、DAB顯色試劑盒、即用型SABC二抗試劑盒、OPG一抗、RANKL一抗（武漢博士德公司）、鹽酸二甲雙胍片（天津太平洋制藥有限公司），其他試劑及儀器皆為山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立2型糖尿病大鼠模型

將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常種植組（T0）、糖尿病種植組（T1）、糖尿病種植二甲雙胍干預(yù)組（T2）。常規(guī)飼養(yǎng)2周后，T1、T2組高脂高糖飲食4周，T0組繼續(xù)給予常規(guī)飲食。4周后在禁食12h的狀態(tài)下T1、T2組一次性腹腔注射0.5%STZ45mg/kg。T0組注射等量的檸檬酸緩沖液。繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)2周后，禁食12h，測量血糖，血糖＞16.7mmol/L視為建模成功，否則給予剔除。

1.3.2 種植體植入及二甲雙胍灌胃

術(shù)前禁食12h，采用2%戊巴比妥1mL/kg腹腔注射麻醉，麻妥后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，右側(cè)脛骨備皮，2%碘伏消毒，切開皮膚及皮下組織，尋找脛骨近骺端，距離近骺端5mm處，在生理鹽水沖洗冷卻下，在骨面用1.3mm×5mm的鉆頭制備種植窩（轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/秒），手用器械植入種植體，生理鹽水沖洗創(chuàng)口，分層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后3d局部注射青霉素預(yù)防感染。種植術(shù)后1周，T2組大鼠每日二甲雙胍灌胃（250mg/kg），根據(jù)血糖水平每3d調(diào)整一次藥物用量使血糖接近T0組水平。T0組、T1組大鼠注射等量生理鹽水。

1.3.3 骨密度檢測

12周后，全麻狀態(tài)下進(jìn)行骨密度檢測。

1.3.4 制作HE切片

切片常規(guī)石蠟脫水：二甲苯（I）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸餾水洗2min。蘇木素染色5min，自來水沖洗。1%鹽酸乙醇分化30sec（提插數(shù)下）。自來水浸泡15min。置伊紅液20sec。自來水洗30sec。脫水，透明:80%乙醇5sec→95%乙醇（Ⅱ）5sec→95%乙醇（I）5sec→100%乙醇5sec→二甲苯（Ⅱ）5sec→二甲苯（I）5sec。樹脂封片。BX-51多功能生物顯微鏡觀察種植體周圍組織學(xué)形態(tài)。

1.3.5 制作免疫組化切片

切片常規(guī)石蠟脫水：二甲苯（I）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸餾水洗2min。3%過氧化氫室溫10min。PBS（Ph7.4）液洗3次，每次3min。微波熱修復(fù)1 min。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20min。滴加一抗（OPG一抗、RANKL一抗，實(shí)驗(yàn)濃度1∶100），4℃過夜。PBS液（pH7.4）洗3次，每次3min。滴加生物素化兔抗兔抗體 37℃30min。PBS液（Ph7.4）洗3次，每次3min。滴加SABC試劑，37℃恒溫箱 20min。PBS液（pH7.4）洗4次，每次5min。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴 ，混均后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，5min后蒸餾水洗終止顯色。蘇木素輕度復(fù)染，自來水洗。脫水，透明：80%乙醇5sec→95%乙醇（Ⅱ）5sec→95%乙醇（I）5sec→100%乙醇5sec→二甲苯（Ⅱ）5sec→二甲苯（I）5sec。樹脂封片。BX-51多功能生物顯微鏡觀察種植體周圍骨組織中OPG和RANKL的免疫組化結(jié)果。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物情況

各組大鼠均健康存活，T1組大鼠明顯消瘦，多飲多食多尿，T2組體質(zhì)量明顯接近T0組，種植術(shù)后3組大鼠種植區(qū)創(chuàng)口愈合良好，未見炎癥和感染，種植體未出現(xiàn)松動脫落。T1組組脛骨明顯骨質(zhì)薄，質(zhì)地脆，T0組和T2組大鼠脛骨較T1組骨質(zhì)較厚，質(zhì)地較韌。

2.2 骨密度檢測檢測結(jié)果

結(jié)果顯示T1組骨密度值低于T0組和T2組，T0組種植體周圍骨密度較T2組高。

2.3 HE染色觀察結(jié)果

T0組與T2組相近，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的數(shù)量均多于T1組。T1組破骨細(xì)胞數(shù)量較其余兩組明顯增多。

2.4 免疫組化結(jié)果

T1組OPG表達(dá)水平比T0和T2組都低，但T0和T2組OPG表達(dá)水平相當(dāng)；T1組RANKL表達(dá)水平比T0和T2組都高，T0和T2組RANKL表達(dá)水平相當(dāng)；在RANKL/OPG比值的兩兩比較中，3組差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其值又高到低分別為T1組、T2組和T0組。

3 討 論

在目前臨床工作中，糖尿病患者實(shí)施口腔種植手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)率一直較高，特別是對于一些血糖控制效果不好的病人，臨床中更將其列為手術(shù)絕對禁忌對象。有研究顯示[1]正常人種植體的長期存活率已超過95%，而Fiorellini發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者種植體1年以上種植成功率從85.6%到94.3%不等[2]。糖尿病是由于胰島素受體或受體后缺陷導(dǎo)致靶細(xì)胞對胰島素的敏感性降低所致，通常認(rèn)為其通過微血管病變、免疫力下降等病理變化，降低機(jī)體組織對致病因子的抵抗力，從而影響骨整合過程。

二甲雙胍是治療胰島素抵抗的重要制劑之一，其降糖作用的主要機(jī)制是增加胰島素抵抗患者脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞的胰島素受體（IR）與胰島素的結(jié)合力，促進(jìn)脂肪、肌肉等周圍組織攝取和利用葡萄糖，抑制肝糖異生及糖原分解，減少肝糖輸出，使血糖下降，同時(shí)可抑制脂肪組織分解，降低游離脂肪酸（FFA）水平，減少對β細(xì)胞的脂毒性，還可降低血胰島素水平，增高胰島素敏感性[3]。已有研究證明骨組織也為胰島素敏感組織，成骨細(xì)胞表面存在高親和性的胰島素受體（IR）[4]，呂嬌[5]等發(fā)現(xiàn)二甲雙胍等顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的葡萄糖攝取，在高血糖引起胰島素反應(yīng)型減弱時(shí)，二甲雙胍能逆轉(zhuǎn)降低的糖運(yùn)轉(zhuǎn)活動，使成骨細(xì)胞的糖攝取進(jìn)一步增強(qiáng)。

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）又稱為破骨細(xì)胞生成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory fanctor，OCIF），其主要功能是抑制破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡。資料顯示OPG是由前肽切除21個(gè)氨基酸的信號肽產(chǎn)生，其含有7個(gè)功能區(qū)（D1～D7），N端的D1～D4區(qū)參與配體結(jié)合，與抑制破骨細(xì)胞的作用直接相關(guān)[6]。核因子КB受體活化因子配體（receptor activator of NFКB ligand，RANKL），又稱骨保護(hù)素配體（osteoprotegerin ligand，OPGL），能特異性的作用于細(xì)胞核因子КB受體活化因子（receptor activator of NF-КB，RANK），從而激活NF-КB，介導(dǎo)骨吸收。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是介導(dǎo)各種物質(zhì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成及功能的最終生物因子，三者共同參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化成熟和骨吸收重建。成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合后，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及骨吸收活性。成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌表達(dá)OPG與RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK之間結(jié)合。體內(nèi)諸多激素和因子通過影響OPG或RANKL的表達(dá)影響骨代謝。吳陳炫[7]等研究顯示糖尿病大鼠比非糖尿病大鼠或經(jīng)胰島素治療的糖尿病大鼠的OPGmRNA表達(dá)更低、RANKLmRNA表達(dá)更高、PANKL/OPG之比也高。相應(yīng)的，糖尿病大鼠破骨細(xì)胞數(shù)比非糖尿病大鼠或經(jīng)胰島素治療的糖尿病大鼠也更多，提示糖尿病時(shí)本身血中異常的激素和細(xì)胞因子的改變，有可能改變牙周局部OPGmRNA和RANKLmRNA表達(dá)，從而導(dǎo)致牙槽骨破壞。本實(shí)驗(yàn)從OPG和RANKL免疫組化結(jié)果來看，T1組OPG表達(dá)水平比T0和T2組都低，但T0和T2組OPG表達(dá)水平相當(dāng)；T1組RANKL表達(dá)水平比T0和T2組都高，T0和T2組RANKL表達(dá)水平相當(dāng)；在RANKL/OPG比值的兩兩比較中，3組差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其值又高到低分別為T1組、T2組和T0組。因此提示糖尿病對種植體周圍骨組織整合過程的影響可能是從升高RANKL表達(dá)水平和降低OPG表達(dá)水平兩方面來起作用的，而二甲雙胍也可以降低血糖，可能通過改變OPG和RANKL的表達(dá)，促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合和骨形成。

[1] Beilker T,Flemming TF. Implants in the medically compromised patient[J]. Crit Rev Oral Biol Med,2003,14(4):305-316.

[2] Fiorellini JP,Chen PK,Nevins M,et al. A restrospective study of dental implants in diabetes patients [J]. Int J Periodontics Restorative Dent,2000,20(4):366-373.

[3] 張軍霞,徐焱成,朱宜蓮.格華止對糖尿病患者高血壓的干預(yù)作用[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2003,5(1):24-25.

[4] Cornish J,Callon KE,Reid IR. Insulin increasedhistomorphometric indices of bone formation in vivo[J]. Calcif Tissue Int,1996,59(6):492-495.

[5] 呂嬌,劉洪臣,吳璇,等.二甲雙胍對高糖環(huán)境下頜骨成骨細(xì)胞影響的機(jī)制研究[J].上?？谇会t(yī)院,2009,18(6):12-13.

[6] 劉長庚,凌天牗,黃生高.OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)及其臨床應(yīng)用[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志,2007,27(6):534-538.

[7] 吳陳炫,劉士有,王永蘭.糖尿病大鼠牙槽骨RANKL、OPG基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué)口腔臨床醫(yī)學(xué),2007.

R587.1

B

1671-8194（2013）19-0092-03

降糖藥物對糖尿病狀態(tài)下植入體穩(wěn)定性影響的研究（編號：20110321084）；二甲雙胍對體外培養(yǎng)停經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化能力的影響（基金號：YB1001）

*通訊作者：E-mail： jiaoyanjun-2000@163.com