股骨頭壞死動(dòng)物模型研究進(jìn)展

張成龍，尹 華，章建華

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

股骨頭缺血性壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是由于不同的病因破壞股骨頭的血液循環(huán)造成骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死的病理過程，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷，髖關(guān)節(jié)功能障礙的一種疾?。?］。近年來發(fā)病率不斷增高，發(fā)病年齡趨于年輕化，因其臨床癥狀較重、致殘率高，治療困難，越來越引起醫(yī)學(xué)界的重視，其中激素性股骨頭壞死占總發(fā)病率的50%以上，并呈逐年上升的趨勢(shì)。

ONFH按照病因分類可分為創(chuàng)傷性股骨頭壞死及非創(chuàng)傷性股骨頭壞死。創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要見于髖部創(chuàng)傷，如:股骨頸骨折、股骨頭骨折、髖關(guān)節(jié)脫位、髖臼骨折等，股骨頭由于血運(yùn)中斷而發(fā)生壞死。非創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要是由于激素濫用、飲酒過量、風(fēng)濕病、血液病等引起。

正因?yàn)楣晒穷^壞死的發(fā)病機(jī)制并不明確，且缺乏切實(shí)有效的早期治療方法，所以建立與人類臨床病理特征相似的股骨頭壞死動(dòng)物模型以研究其發(fā)病機(jī)制及尋求有效的治療方法顯得尤為重要。現(xiàn)就目前股骨頭壞死動(dòng)物模型建立的研究進(jìn)展綜述如下。

1 模型動(dòng)物的選擇

國內(nèi)外學(xué)者的研究中，選擇用來建立股骨頭壞死動(dòng)物模型的動(dòng)物包括四足類動(dòng)物(如大鼠、兔、犬、豬、羊、馬)和雙足類動(dòng)物(雞、鵝、鹋鴯)。

雙足類動(dòng)物的特點(diǎn)是雙下肢負(fù)重，與人類的負(fù)重方式相似，突出生物力學(xué)在ONFH病程中的作用。雞的股骨頭壞死的進(jìn)程與人類相似，病理變化接近人類。曾有國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用雞、鹋鴯建立激素性股骨頭壞死模型［3－4］。但是雞與人類的親緣性較遠(yuǎn)，人們對(duì)其解剖學(xué)及生理學(xué)上的認(rèn)識(shí)較少。且鹋鴯來源有限，飼養(yǎng)難度大，限制了其廣泛應(yīng)用。

應(yīng)用于ONFH造模四足類動(dòng)物多屬哺乳類動(dòng)物，生物進(jìn)化上與人類較近。應(yīng)用最多的是大鼠、兔和犬。其中大鼠的骺生長板終生存在，常用來制作兒童股骨頭骨骺壞死(Perthes'病)動(dòng)物模型;自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)易患多種骨骼疾病(包括ONFH)，可以模擬Perthes'病的自然病程;大鼠沒有嘔吐反射，用作灌胃法制作酒精性 ONFH模型，劑量確切;大鼠也用作激素性 ONFH模型建立，馬信龍等人［5］嘗試 Wistar大鼠臀肌注地塞米松磷酸鈉20mg/kg，每周1次，并每天輔以強(qiáng)制活動(dòng)，8周后造模成功。用兔作ONFH模型的研究也較多，特別是用作激素性股骨頭壞死模型［6－10］，但兔在病程上與人類激素性股骨頭壞死病程不符，病理變化差別大;犬的體形較大，較適合于外科手術(shù)建模［11］。羊的長骨粗大，脂肪豐富，易于發(fā)生減壓性骨壞死，是制作減壓性骨壞死動(dòng)物模型的最好動(dòng)物［12］。豬和馬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模的相對(duì)較少［13］。同時(shí)由于豬、羊等大動(dòng)物成模時(shí)間長，實(shí)驗(yàn)成本高，成功率較低，死亡率高，較少應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究。

理想的股骨頭壞死動(dòng)物模型首先要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要與人具有較好的親緣性及相似性，所選動(dòng)物的解剖和生理學(xué)特點(diǎn)盡可能與人類相似，符合人類ONFH病變規(guī)律，即從早期的病理組織學(xué)改變到晚期的股骨頭塌陷，股骨頭壞死區(qū)域應(yīng)接近軟骨面并與周圍活骨相連接，且在壞死修復(fù)過程中股骨頭應(yīng)承載正常的應(yīng)力;可重復(fù)性好，便于檢測(cè)評(píng)價(jià);經(jīng)濟(jì)可行。

2 造模方法

2.1 激素造模

從20世紀(jì)已經(jīng)有學(xué)者用不同方法建立激素性股骨頭壞死模型。

2.1.1 單純激素誘導(dǎo):趙廣輝等人對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行每周2次的臀肌注地塞米松磷酸鈉(8mg/kg)，分別于3周、6周后觀察到股骨骨密度及組織病理學(xué)上的軟骨改變［14］。據(jù)趙金東等人研究，用40mg/kg甲基強(qiáng)的松龍臀肌注中國大耳白兔造模，8周后模型建立成功［15］。研究報(bào)道也有學(xué)者選擇SD大鼠造模，每周2次臀肌注醋酸潑尼松龍(24.5 mg/kg)連續(xù)6周，大鼠股骨頭骨小梁模糊，空骨陷窩率明顯升高［16－17］。

2.1.2 激素聯(lián)合馬血清誘導(dǎo):模擬臨床上高免疫狀態(tài)下大劑量使用激素造成的股骨頭壞死。王偉等人應(yīng)用馬血清10 mL/kg，經(jīng)兔耳緣靜脈注射3周后，減量為6 mL/kg再次注射2周后，腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍，按45 mg/kg連續(xù)3天，每天注射1次，可造成激素性壞死模型［18］。

2.1.3 激素聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo):模擬高凝血狀態(tài)下使用激素導(dǎo)致的股骨頭壞死。童培健等人［19］選用Wistar大鼠，腹腔注射內(nèi)毒素 20 μg/kg兩天，臀肌注甲強(qiáng)龍40 mg/kg三天，6周后組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型組壞死率達(dá)70%。黃克勤等［20］研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠尾靜脈注射內(nèi)毒素10 μg/kg 1次，肌注20 mg/kg甲強(qiáng)龍4天，6周后模型建立成功。據(jù)趙金東等人［21］研究報(bào)道顯示，對(duì)中國大耳白兔進(jìn)行耳緣靜脈注射內(nèi)毒素(50 μg/kg)兩天后臀肌注甲強(qiáng)龍(40 mg/kg)三天，4周后 MRI掃描，造模組兔T1WI表現(xiàn)為右側(cè)股骨頭信號(hào)減低，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組骨小梁數(shù)目明顯減少，斷裂，但模型組動(dòng)物死亡率較高。

激素造模法的應(yīng)用越來越廣泛，但在各家報(bào)道中，建立ONFH動(dòng)物模型所用激素的類型，劑量以及致ONFH發(fā)生率均不同。對(duì)激素劑量的研究方面目前還沒有大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明ONFH發(fā)病的最佳用藥劑量，同時(shí)針對(duì)內(nèi)毒素、激素的用量過大導(dǎo)致的動(dòng)物死亡這方面的文獻(xiàn)報(bào)道也不多。因此對(duì)激素類型、用量的考察對(duì)于完善激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型的建立有著重要意義。

2.2 酒精造模

過度的酒精引起肝的損害，脂肪肝又產(chǎn)生了脂肪栓子。脂肪栓子對(duì)非創(chuàng)傷性骨壞死起關(guān)鍵作用［22］。郭天明［23］曾用雄性 Wistar大鼠每次以 56度白酒灌胃(10 mL/kg)連續(xù)兩天后停一天，持續(xù)24周后，血液生化指標(biāo)顯示 HDL-C、LDL值均較正常組低;組織病理學(xué)顯示部分骨小梁出現(xiàn)空骨陷窩，多于50%。齊振熙等［24］對(duì)SD大鼠給予56度白酒8 mL/kg·d(含純酒精約 4 g/kg·d)灌胃，20 周后處死動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組股骨頭軟骨層較薄，軟骨下骨小梁變細(xì)，間距增大，結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁有斷裂。

酒精性股骨頭壞死模型的建立主要問題在于灌胃劑量的選擇及造模時(shí)間。在大鼠能耐受的情況下，應(yīng)盡可能采取大劑量和高頻度灌胃。但在保證實(shí)驗(yàn)大鼠不發(fā)生酒精中毒致死的情況下，造模時(shí)間仍然較長，增加了飼養(yǎng)的難度。

2.3 創(chuàng)傷性造模

成年創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備有液氮冷凍法、手術(shù)破壞骨髓法、選擇性血管結(jié)扎法、局部細(xì)胞滅活法等。

2.3.1 液氮冷凍法:有學(xué)者用液氮冷凍法造成犬整個(gè)股骨頭壞死及修復(fù)反應(yīng)，但壞死由外向內(nèi)，且一周后即出現(xiàn)股骨頭外形改變和骨性關(guān)節(jié)炎［25－26］。但液氮冷凍法造成的動(dòng)物股骨頭壞死模型的骨壞死與臨床有一定的差別，對(duì)臨床的指導(dǎo)有很大的局限性。

2.3.2 手術(shù)破壞骨髓法:李印良等［27］通過將兔圓韌帶切斷，在近股骨附著點(diǎn)處環(huán)形切斷結(jié)扎關(guān)節(jié)囊，股骨頸基底部鉆直徑2 mm骨孔，破壞骨髓的方法制作股骨頭壞死模型。此方法造成缺血性壞死缺點(diǎn)是手術(shù)創(chuàng)傷大，壞死的修復(fù)可能會(huì)受到多方面因素的影響，修復(fù)時(shí)間較長，不利于短期內(nèi)觀察其完整的修復(fù)過程。

2.3.3 選擇性血管結(jié)扎法:Nakamura等［27］結(jié)扎狗股骨頭周圍血管，并使髖關(guān)節(jié)后脫位9 h，術(shù)后3 d、1、2、4周進(jìn)行 MRI及組織切片觀察，組織切片3 d開始出現(xiàn)異常，MRI 1周開始出現(xiàn)異常。動(dòng)脈和靜脈的結(jié)扎雖然能引起骨壞死，但造模時(shí)間長，骨的修復(fù)較為明顯，造成的模型往往不典型。

2.3.4 局部細(xì)胞滅活法:彭吾訓(xùn)等［28］將微波天線插入兔股骨頭進(jìn)行微波滅活，1、2、4、8和12周后利用X射線、MRI檢測(cè)股骨頭影像。55℃，10 min微波滅活后，4周時(shí)壞死與修復(fù)同時(shí)進(jìn)行，8周時(shí)壞死骨小梁及骨髓組織完全吸收，12周時(shí)骨修復(fù)停止，骨壞死繼續(xù)，股骨頭開始塌陷。楊明亮等［29］則利用家兔股骨頭內(nèi)注射鹽酸、氫氧化鈉的方法造模，6周左右即可出現(xiàn)典型的骨壞死。但滅活法與人類臨床的發(fā)病過程不一致，對(duì)于臨床股骨頭壞死病程發(fā)展及治療方法研究指導(dǎo)意義不大。

3 ONFH動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)

在股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究中，判定動(dòng)物模型是否復(fù)制成功，是至關(guān)重要的一步。對(duì)模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)有以下研究:

3.1 大體觀察及X線片

已造成股骨頭壞死的模型股骨頭松脆，易于剖開鑿切。X線往往顯示股骨頭周圍骨質(zhì)變疏松，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁模糊不清或消失，股骨頭內(nèi)有散在低密度區(qū)的表現(xiàn)。但此項(xiàng)指標(biāo)不適用于早期股骨頭壞死的診斷。

3.2 組織形態(tài)學(xué)檢查

賀西京等［30］于光鏡下觀察了壞死的股骨頭組織，發(fā)現(xiàn)第4周開始，軟骨下骨區(qū)骨小梁部分骨細(xì)胞核固縮，胞核較小，染色深，空缺骨陷窩數(shù)增多，透射電鏡下觀察到較多的骨細(xì)胞發(fā)生核固縮及骨細(xì)胞破裂成碎片，出現(xiàn)了股骨頭骨細(xì)胞的壞死。本課題組經(jīng)過前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，股骨頭壞死大鼠股骨頭表面出現(xiàn)不平整，骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，甚至斷裂現(xiàn)象，骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞逐漸增大。由于骨壞死的確診標(biāo)志是骨和骨髓死亡的組織學(xué)證據(jù)，所以此項(xiàng)指標(biāo)被廣泛采用。

3.3 血生化測(cè)定

生化測(cè)定是對(duì)骨壞死的一種定量分析。學(xué)者在研究股骨頭壞死過程中，發(fā)現(xiàn)模型組動(dòng)物涉及到脂代謝的各項(xiàng)血脂指標(biāo)，包括總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度低蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血漿脂聯(lián)素含量與正常組動(dòng)物有顯著性差異［31］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，股骨頭壞死動(dòng)物的血清P含量均較正常組低、血清Ca含量則無顯著性差異，這可能與骨中鈣元素的融出有關(guān)。目前尚無對(duì)動(dòng)物股骨頭壞死進(jìn)行分期的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，單獨(dú)依靠血生化的指標(biāo)來評(píng)價(jià)股骨頭壞死模型復(fù)制成功與否是不全面，亦是不合理的，血生化指標(biāo)的測(cè)定與組織形態(tài)學(xué)等其他指標(biāo)結(jié)合的方法可作為參考，有助于判斷骨壞死的程度。

3.4 骨生物力學(xué)、骨Ca、P和骨密度

根據(jù)股骨頭壞死的綜合分期，在骨壞死早期，會(huì)出現(xiàn)輕微的骨質(zhì)疏松，整個(gè)股骨頭壞死的發(fā)病期間經(jīng)歷一個(gè)共同的骨質(zhì)疏松的病理過程［1］。在股骨頭壞死動(dòng)物模型中，利用骨生物力學(xué)中股骨彎曲載荷值、單位面積最大載荷量、彈性模量的測(cè)定［32］，可以顯示出壞死動(dòng)物股骨脆性明顯增加，骨質(zhì)明顯疏松。骨中的 Ca、P是骨礦物質(zhì)的主要成分，股骨中Ca、P含量的高低是衡量骨質(zhì)的一個(gè)非常重要標(biāo)志。Ca、P含量低，說明骨質(zhì)松脆，反應(yīng)在骨生物力學(xué)上的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)更加明顯。骨密度，是骨質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志，反映骨質(zhì)疏松程度。也曾有學(xué)者［33］研究發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死的新西蘭大白兔骨密度比正常組明顯偏低，有非常顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此骨生物力學(xué)、骨 Ca、P及骨密度可作為股骨頭壞死動(dòng)物模型建立成功的間接性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.5 股骨頭血管造影

王銳英等［34］認(rèn)為血管造影可用于股骨頭壞死的早期診斷。股骨頭血管密度最低生理限度是多少，破壞或減少到何種程度可產(chǎn)生不可逆損害，可作為早期診斷股骨頭壞死的標(biāo)準(zhǔn)，尚有待進(jìn)一步研究。

3.6 骨內(nèi)壓

文獻(xiàn)早有報(bào)道骨內(nèi)壓與骨壞死的密切關(guān)系，在股骨頭壞死的早期，骨內(nèi)壓就有明顯的增高。曾有研究者采用測(cè)量骨內(nèi)壓的方法，早期診斷股骨頭壞死，準(zhǔn)確率高［35］。因此，骨內(nèi)壓也被認(rèn)為可以用作于間接判斷股骨頭壞死模型是否成功。

綜上所述，復(fù)制股骨頭壞死動(dòng)物模型的方法很多，但是由于 ONFH的發(fā)病機(jī)理尚未完全明確，以及人和動(dòng)物在生理解剖上存在的差異，現(xiàn)今還沒有一種公認(rèn)的方法可以完全復(fù)制與人ONFH自然病理過程相一致的動(dòng)物模型。近年來由于我國臨床上激素應(yīng)用的增多，由于濫用激素引發(fā)的激素性股骨頭壞死發(fā)病率也逐年增高，應(yīng)當(dāng)提高對(duì)激素性股骨頭壞死的重視。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型的研究越來越多，但應(yīng)用于造模的激素類型種類繁多，激素應(yīng)用劑量也不盡相同，甚至有的學(xué)者在不同的造模動(dòng)物之間采用體表面積換算的方法確定造模劑量。另外關(guān)于高劑量激素引起的動(dòng)物死亡率問題沒有很多文獻(xiàn)報(bào)道，能夠使ONFH模型復(fù)制成功的最佳激素劑量亦尚無學(xué)者做過相關(guān)研究。另外在評(píng)價(jià)模型成立與否的評(píng)價(jià)指標(biāo)方面，許多文獻(xiàn)研究中所選用的檢測(cè)指標(biāo)也有待商榷，如血清鈣、血清磷含量，血脂等。在前期課題組的研究中發(fā)現(xiàn)血中的鈣、磷含量變化可能與骨頭中的鈣、磷元素的融出有關(guān)，而血脂的變化受多種因素的影響，不宜將其作為評(píng)價(jià)股骨頭壞死的特異性指標(biāo)。因此還需進(jìn)一步確定更為直觀、更能反映骨壞死本質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。綜上所述，對(duì)激素類型、劑量的考察以優(yōu)化激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型的建立，以及形成合理、系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系應(yīng)當(dāng)是今后股骨頭壞死動(dòng)物模型領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

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