病炎清顆粒抗甲型流感病毒的體外實(shí)驗(yàn)*

喬秋杰 曲敬來(lái) 高 雪 張 忠

（廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

病炎清顆粒是本課題組20 余年的中醫(yī)疫病臨床經(jīng)驗(yàn)方，其采用有效而且具有獨(dú)特抗流感病毒作用的中草藥配制而成。本實(shí)驗(yàn)采用MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法，觀(guān)察病炎清顆粒體外抗甲型流感病毒的抑制作用，并與對(duì)照組清開(kāi)靈注射液、病毒唑進(jìn)行比較，探討其對(duì)甲型流感病毒感染的治療作用及可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物 病炎清顆粒：連翹30 g，馬勃30 g，桔梗12 g，牛蒡子20 g，柴胡20 g，黃芩12 g，僵蠶10 g，薄荷12 g，白前12 g，百部12 g，荊芥12 g，莪術(shù)10 g，甘草10 g。以上藥物共202 g，加入溫開(kāi)水稀釋成202 mL，相當(dāng)于每mL 所含生藥1 g。清開(kāi)靈注射液，廣州白云山明興制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44022855。病毒唑（三氮唑核苷RIBAVIRIN），浙江康裕藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：960501。

1.2 病毒株及細(xì)胞株 病毒株：流感病毒甲型A/粵防/243/72（H1N1），中國(guó)醫(yī)科院生物技術(shù)研究所提供。細(xì)胞株：狗腎傳代細(xì)胞（MDCK），中國(guó)醫(yī)科院生物技術(shù)研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)液：含10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL的鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)液（中國(guó)醫(yī)科院生物技術(shù)研究所提供）。細(xì)胞維持液除所含小牛血清為2%外，其他含量均同細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3 藥物處理 病炎清顆粒、清開(kāi)靈注射液的第一濃度為藥物母液稀釋3 倍，再用培養(yǎng)液作2 倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度。稀釋度分別為1∶3、1∶6、1∶12、1∶24、1∶48、1∶96、1∶192、1∶384。

1.4 藥物對(duì)MDCK 細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 將MDCK 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后，形成細(xì)胞單層。加入用細(xì)胞維持液稀釋的不同濃度待測(cè)藥物（稀釋度見(jiàn)上），37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h，顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，并用噻唑藍(lán)（MTT）比色法在590 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A 值，按如下式計(jì)算細(xì)胞存活率，確定藥物的半數(shù)毒性濃度（TD50）和最大無(wú)毒濃度（TD0）。每個(gè)劑量藥物加入4 孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和空白組。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔A 值／對(duì)照孔A值）×100%

1.5 測(cè)試方法 MDCK 細(xì)胞種96 孔培養(yǎng)板，24 h 后感染甲型流感病毒，吸附2 h，棄病毒液。加入以上稀釋度的藥物，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔，觀(guān)察24 h細(xì)胞病變程度（CPE），用Reed～Muench 法分別計(jì)算藥物對(duì)甲型流感病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50）。并計(jì)算選擇指數(shù)（SI＝TD50/IC50）。細(xì)胞病變程度表示法：“-”為細(xì)胞生長(zhǎng)正常，無(wú)病變出現(xiàn)；“+”為細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的25%以下；“++”為細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的50%以下；“+++”為細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以下；“++++”為細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)操作均按病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)進(jìn)行［1］。結(jié)果表明：病炎清顆粒在1∶24（相當(dāng)于生藥41.67 mg/mL）稀釋度時(shí)達(dá)到TD50，在1∶48（相當(dāng)于生藥20.83 mg/mL）稀釋度時(shí)達(dá)到TD0，在1∶96（相當(dāng)于生藥10.42 mg/mL）稀釋度時(shí)達(dá)到IC50，選擇指數(shù)SI＝4.0。而清開(kāi)靈注射液在1∶19.4 稀釋度時(shí)達(dá)到TD50，在1∶35.2 稀釋度時(shí)達(dá)到TD0；在1∶49.1 稀釋度時(shí)達(dá)到IC50，選擇指數(shù)SI＝2.53。病毒唑?qū)仔土鞲胁《镜陌霐?shù)抑制濃度IC50＝5.91 μg/mL。結(jié)果提示，病炎清顆粒對(duì)流感病毒甲型所致的細(xì)胞病變有一定的抑制作用，優(yōu)于中藥對(duì)照組，與西藥對(duì)照組相近。

病炎清顆粒在1∶24時(shí)相當(dāng)于生藥41.67 mg/mL，在1∶48時(shí)相當(dāng)于生藥20.83 mg/mL，在1∶96 相當(dāng)于生藥10.42 mg/mL。

3 討論

中藥抗流感病毒基本原理是扶正祛邪或祛邪扶正。國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥抗流感病毒有效部位或成分的篩選研究表明［2］：中藥抗流感病毒主要有直接滅活或抑制病毒和通過(guò)誘生干擾素或調(diào)節(jié)人體免疫功能而間接抑制病毒兩種方式?，F(xiàn)有的研究也表明［3］，中藥復(fù)方具有抑制流感病毒復(fù)制、阻止流感病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫功能、改善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎等綜合作用，使流感痊愈。

病炎清顆粒是本課題組多年的疫病經(jīng)驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)采用MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行病炎清顆?？辜仔土鞲胁《镜捏w外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其在體外具有較強(qiáng)的抗甲型流感病毒的作用，且毒副作用小、安全性高；綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，病炎清顆?？辜仔土鞲胁《镜淖饔脵C(jī)理可能為既調(diào)節(jié)人體免疫功能而間接抑制病毒，又抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)制增殖。但由于單味中藥成分復(fù)雜不清，復(fù)方中藥又涉及單味中藥之間的相互作用，因此對(duì)于具有多組分、多種作用途徑的中藥來(lái)說(shuō)，其抗流感病毒機(jī)理也相對(duì)復(fù)雜，尚有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病研究所.常見(jiàn)病毒病實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，1987：213.

［2］馮書(shū)曉，陳文，馮俊陽(yáng)，等.抗流感病毒植物藥有效部位篩選研究概括［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（11）：101.

［3］胡旭，邱全瑛，姜良鐸.中醫(yī)藥抗呼吸道流感病毒感染實(shí)驗(yàn)研究概括［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（2）：180.