一種新的細(xì)胞周期蛋白
——Cyclin Y的功能和分子機(jī)制的研究進(jìn)展

趙曉婷 江妹 岳文濤

細(xì)胞周期素（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase, CDK）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI）是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子，廣泛存于真核生物細(xì)胞中，它們一起組成細(xì)胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[1,2]。近年的大量研究顯示，在細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過程中，除了癌基因與抑癌基因的正負(fù)調(diào)控之外，細(xì)胞周期調(diào)控分子也參與了細(xì)胞的癌變過程。從一定程度說，腫瘤被認(rèn)為是一種細(xì)胞周期病，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控的失調(diào)密切相關(guān)[3]。細(xì)胞周期素是一類隨著細(xì)胞周期變化呈現(xiàn)周期性出現(xiàn)和消失的蛋白，他們的共同特點(diǎn)是具有100個(gè)-150個(gè)氨基酸組成的周期素盒（cyclin box）保守序列，不同周期素可利用該序列結(jié)合不同CDKs，控制細(xì)胞周期啟動(dòng)和關(guān)鍵監(jiān)測(cè)點(diǎn)（check point），在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮作用[1,4]?，F(xiàn)有研究[5]表明幾乎所有已知周期素在在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中都起到關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期素E（cyclin E）在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌中高表達(dá)，而細(xì)胞周期素D（cyclin D）與非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、胰腺癌、膽囊癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)生相關(guān)[6,7]。近年來，陸續(xù)有一些新的周期素蛋白被發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期素Y（cyclin Y, CCNY）即為其中之一。作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期素，cyclin Y極有可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的功能，現(xiàn)就cyclin Y的研究進(jìn)展及其與腫瘤的關(guān)系做一綜述。

1 Cyclin Y的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Cyclin Y又稱CCNY、cyc-Y、周期素盒蛋白1（cyclin box protein 1）、周期素折疊蛋白1（cyclin fold protein 1）或周期素盒攜帶蛋白1（cyclin-box carrying protein 1），是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞周期蛋白。其編碼基因CCNY定位于10號(hào)染色體，全長3,968 bp，有10個(gè)外顯子、9個(gè)內(nèi)含子。Cyclin Y蛋白含有341個(gè)氨基酸，分子量約為39KD，其中143-243位氨基酸高度保守，是CDK結(jié)合結(jié)構(gòu)域，亦稱為周期素盒。最近，研究者發(fā)現(xiàn)了cyclinY的一種異構(gòu)體——cyclin X（CCNX），除了缺失cyclin Y N末端54個(gè)氨基酸殘基外，其余蛋白序列與Cyclin Y序列完全相同[8]。

2 Cyclin Y的亞細(xì)胞定位

Cyclin Y的N端第二位氨基酸即甘氨酸為豆蔻?；稽c(diǎn)，將cyclin Y定位于細(xì)胞膜，而cyclin X的N末端由于缺少豆蔻?；稽c(diǎn)，在細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核[8]。中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞所的研究人員成功將CCNY基因及其N端突變體克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N3、pEGFP-C2、pcDNA3-2HA和pMycN3中，發(fā)現(xiàn)野生型cyclin Y在半轉(zhuǎn)化型細(xì)胞HEK293T細(xì)胞中定位于細(xì)胞膜，N端豆蔻酰化位點(diǎn)突變的突變體在HEK293T細(xì)胞中定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中[9]，這與Mikolcevic等[10]的研究發(fā)現(xiàn)是一致的。另外，Li[8]等將目的基因CCNX克隆至真核表達(dá)載體pCMV-Myc中，發(fā)現(xiàn)CCNX的N末端缺少豆蔻酰化位點(diǎn)在人肺癌細(xì)胞系H1299中主要定位于細(xì)胞核。在我們的研究中也得到了類似的結(jié)果，人肺癌細(xì)胞系H1299中外源性CCNX主要在細(xì)胞核表達(dá)。大量的研究顯示蛋白質(zhì)的功能與其亞細(xì)胞的定位密切相關(guān)。例如，Lonardod等[11]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中Maspin的胞質(zhì)定位提示預(yù)后不良，若在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)則預(yù)后較好。但是cyclinY與cyclin X之間的關(guān)系以及兩者在細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)情況及定位尚不明確。

3 Cyclin Y的功能與分子機(jī)制

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。M期即為細(xì)胞分裂期。細(xì)胞周期受到由細(xì)胞周期蛋白（也稱為周期素）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶和CDK抑制物構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控，該系統(tǒng)針對(duì)多個(gè)細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)嚴(yán)格控制細(xì)胞周期的運(yùn)行[1,2]。例如cyclin D激活CDK4或CDK6掌控G1期的細(xì)胞生長[12,13]；Cyclin E作為CDK2的一個(gè)正向的調(diào)節(jié)亞單位，促使細(xì)胞進(jìn)入S期[12,14]。現(xiàn)有的研究表明，細(xì)胞周期內(nèi)有兩個(gè)階段最為重要即G1期到S期和G2期到M期。細(xì)胞周期的運(yùn)行主要依賴于CDK，該酶通過與細(xì)胞周期蛋白相結(jié)合產(chǎn)生活性，促進(jìn)細(xì)胞周期中G1期到S期和G2期到M期的轉(zhuǎn)變。

現(xiàn)有的研究[15]表明cyclinY高度保守，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。但是關(guān)于cyclin Y的功能和作用機(jī)制尚不清楚。目前CCNY基因功能在果蠅中研究比較清楚。在果蠅中CCNY基因命名為CG14939，在果蠅的胚胎發(fā)生中具有重要的作用，Cyclin Y基因突變后會(huì)導(dǎo)致果蠅生長遲緩，發(fā)育產(chǎn)生缺陷或畸形。Liu等[16]采用免疫共沉淀技術(shù)鑒定出Cyclin Y與果蠅Ecdysone-induced protein 63E（Eip63E）結(jié)合；Eip63E基因編碼5種高度相關(guān)、且具有CDK同源結(jié)構(gòu)域的蛋白亞型,是果蠅中與cyclin Y結(jié)合的CDK。Davidson等[17]研究證實(shí)，膜定位的Cyclin Y與Eip63E結(jié)合，通過磷酸化LRP6 1490位絲氨酸活化Wg/Wnt信號(hào)通路，促使果蠅細(xì)胞通過G2期/M期檢查點(diǎn)進(jìn)入M期。通過NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)Eip63E的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)人類基因組中基因序列與Eip63E基因序列同源的有PCTAIRE protein kinase 1（PCTK1）、 PCTK2、PCTK3、PFTAIRE protein kinase 1 （PFTK1）、PFTK2、CDK5等。PCTAIRE激酶（PCTAIRE kinases, PCTKs）與PFTAIRE激酶（PFTAIRE kinases, PFTKs）屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在真核生物中高度保守，具有CDK2激酶結(jié)構(gòu)域的同源序列,是近年來發(fā)現(xiàn)具有CDK功能的激酶，屬于cdc2相關(guān)的激酶，又名為CDK14[18,19]。與哺乳動(dòng)物中，PFTAIRE具有Eip63E與cyclin結(jié)合的α-螺旋區(qū)的氨基酸序列的同源區(qū)，因此認(rèn)為PFTAIRE是Eip63E的同源CDK[16]。Gary Davidson團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅中，PFTK1可以使Wnt受體之一LRP6的1490位絲氨酸磷酸化，從而參與Wg/Wnt信號(hào)通路的活化[17]。

酵母雙雜交的研究結(jié)果說明， PFTK1可以與CCNY相互作用，而亞細(xì)胞定位分析說明細(xì)胞中CCNY的一種異構(gòu)體定位于細(xì)胞膜上，因此，細(xì)胞膜上的CCNY可能通過與PFTK1的結(jié)合，將PFTK1固定在膜上，引起細(xì)胞膜蛋白LRP6的磷酸化[17]。作為細(xì)胞周期蛋白，CCNY在細(xì)胞中的水平隨細(xì)胞周期的變化而變化，在G2/M期水平達(dá)到最高；而LRP6 1490位絲氨酸的磷酸化水平也在G2/M期達(dá)到最高，這充分說明CCNY極可能通過PFTK1參與了Wg/Wnt信號(hào)通路的活化。但是，CCNY參與人類細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)理仍不完全清楚，胞漿分布的PFTK1如何轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜與CCNY結(jié)合是需要解決的關(guān)鍵問題。而且，在人類細(xì)胞中，CCNY是否能夠與其他的CDK結(jié)合尚不清楚。

最近，Mikolcevic等通過免疫共沉淀及酵母雙雜交的方法證實(shí)另一個(gè)與Cyclin Y相作用的CDK，即PCTAIRE 1（PCTAIRE kinases 1, PCTK1)，又名CDK16，它與CDK14序列上高度同源；Cyclin Y依賴磷酸化作用與PCTK1相結(jié)合并使其共定位于細(xì)胞膜；另一方面，Cyclin Y增強(qiáng)了PCTK1激酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)精子的形成[10,20]。

4 Cyclin Y與腫瘤

關(guān)于Cyclin Y在腫瘤中的功能及作用機(jī)制的報(bào)道比較少，與之相關(guān)的研究尚處于起步階段。根據(jù)已有的研究，CCNY與CCNX在腫瘤中的作用與分子機(jī)制可能有所不同。中科院上海生命科學(xué)研究院Jiang等利用Northern blot檢測(cè)了多種人體組織和細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其中至少存在兩種Cyclin Y轉(zhuǎn)錄本，分別為4 kb和2 kb，4 kb轉(zhuǎn)錄本在所有檢測(cè)的組織和細(xì)胞系中低水平表達(dá)，2 kb轉(zhuǎn)錄本則在睪丸等細(xì)胞分裂旺盛的細(xì)胞中高表達(dá)，在骨骼肌、腦等組織中低表達(dá)，而在正常肺組織中無表達(dá)[9]。這說明2 kb Cyclin Y轉(zhuǎn)錄本更能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，在腫瘤增殖調(diào)控中可能發(fā)揮重要的功能。但是，由于CCNX與CCNY相比，只是在N端缺少了54個(gè)氨基酸，已有的抗體的抗原表位均位于CCNY與CCNX的共有序列，所以在蛋白檢測(cè)方面很難將CCNY與CCNX區(qū)分開；而且，在已有的報(bào)道中，多應(yīng)用RNA干擾技術(shù)（RNA interference, RNAi）對(duì)cyclin Y的功能進(jìn)行研究，而RNA干擾的靶點(diǎn)也位于CCNY與CCNX的共有序列，所以難以將CCNY與CCNX的功能進(jìn)行區(qū)分，大多數(shù)報(bào)道尚未對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。

作者前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCNY基因在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織（n=60）和肺癌細(xì)胞系（n=12）中高表達(dá)，CCNY基因的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織類型以及腫瘤的大小具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；利用RNA干擾技術(shù)抑制CCNY基因的表達(dá)可顯著抑制H1299、95D肺癌細(xì)胞增殖的速度及小鼠體內(nèi)成瘤的效率；CCNY基因沉默后肺癌細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，從而顯著抑制肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長[21,22]。同樣，在直腸癌的研究中也有類似的結(jié)果，Ying-Tao等[23]通過質(zhì)譜分析的方法篩選出Cyclin Y蛋白在轉(zhuǎn)移性的人直腸癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)；而且，高表達(dá)Cyclin Y能促進(jìn)直腸癌瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞的粘附、凋亡及腫瘤的免疫等方面發(fā)揮重要的作用，進(jìn)而可能與直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，Cyclin Y還能促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。利用RNAi抑制CCNY表達(dá)可明顯抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成以及細(xì)胞周期的進(jìn)程。綜上所述，Cyclin Y與腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)，但是目前Cyclin Y在其它腫瘤中作用研究的很少[24]。

另外，研究表明與Cyclin Y結(jié)合的CDK PFTK1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)生重要的功能。Pang等[18]研究發(fā)現(xiàn)PFTK1在肝癌組織中高表達(dá)，PFTK1基因的表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及微血管轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)PFTK1可能通過改變F-肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲。Miyagaki等通過免疫組化的方法檢測(cè)了223例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中PFTK1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PFTK1蛋白不但在食管癌組織中高表達(dá)而且與食管癌的預(yù)后也密切相關(guān)；PFTK1過表達(dá)者的生存率明顯低于低表達(dá)者，同時(shí)對(duì)化療的耐藥性也顯著提高，提示其可作為有效的預(yù)后及化療療效觀察的因子[25]。這也說明Cyclin Y在腫瘤進(jìn)展中極有可能具有重要的作用。

5 應(yīng)用前景

目前越來越多的研究證實(shí)Cyclin Y作為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其基因和編碼蛋白的異常，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)程及腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。但是目前對(duì)Cyclin Y的研究尚少，還存在不少的問題。例如：Cyclin Y在其它腫瘤中表達(dá)情況尚不明確；Cyclin Y與其它腫瘤相關(guān)基因的相互作用機(jī)制尚未十分清楚；Cyclin Y與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性還有待進(jìn)一步明確；Cyclin Y在腫瘤中的功能與作用機(jī)制還亟需進(jìn)一步的探索和研究。深入研究Cyclin Y不僅有助于揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制，并可為腫瘤的防治提供一個(gè)新的視點(diǎn)。