以金黃色葡萄球菌致病因素為靶點的免疫療法研究進(jìn)展

王曉麗，尹建永，瞿洪平

金葡菌是引起皮膚和軟組織感染的主要病原菌，嚴(yán)重感染者可引起致命性的肺炎、血流感染、感染性心內(nèi)膜炎以及化膿性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等。2011年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，臨床分離的革蘭陽性菌中金葡菌檢出率最高，占35.6%，其中耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的平均檢出率高達(dá)50.6%［1］。研究發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺、達(dá)托霉素以及替加環(huán)素等新型抗菌藥物的使用并沒有明顯降低金葡菌和MRSA的感染率及病死率，相反由于抗生素的選擇壓力可導(dǎo)致病原菌的耐藥性進(jìn)一步增高，已有報道萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度（MIC）發(fā)生漂移［2］。因此，尋找新的抗感染輔助和替代療法顯得尤為重要。了解金葡菌生長、新陳代謝、毒力表達(dá)等致病機(jī)制，針對這些致病因素的免疫療法是目前臨床研究熱點。

近年來，免疫療法在金葡菌感染的動物實驗和前期臨床試驗中取得進(jìn)展。其中，表達(dá)金葡菌抗原的滅活疫苗可通過主動免疫提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力，而被動免疫抗體主要通過抑制金葡菌黏附能力、中和細(xì)菌外毒素等方式降低病原菌的致病性并延緩耐藥基因產(chǎn)生，有效預(yù)防和治療金葡菌感染。現(xiàn)將近年來以金葡菌致病因素為靶點的免疫療法研究進(jìn)展作一綜述。

一、針對黏附性基質(zhì)分子表面識別因子（MSCRAMMs）的免疫療法

MSCRAMMs是金葡菌細(xì)胞壁相關(guān)的表面黏附素，通過分選酶（sortase）識別其保守的LPXTG（L亮氨酸、P脯氨酸、X任何氨基酸、T蘇氨酸、G甘氨酸）基序而錨定在細(xì)胞壁肽聚糖上，可以識別宿主細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖維蛋白原和纖連蛋白等，使金葡菌定植、侵襲宿主組織細(xì)胞并逃避機(jī)體免疫應(yīng)答。此外，MSCRAMMs與慢性感染中生物膜的形成有關(guān)［3］。金葡菌的MSCRAMMs包括20多種致病因子，目前研究較多的MSCRAMMs成分有凝集因子A和B、膠原黏附素、鐵調(diào)控表面決定因子A和B、表面蛋白A、纖連蛋白A和B以及絲氨酸天冬氨酸重復(fù)蛋白D、E和G等［4］。

（一）凝集因子A 凝集因子A可介導(dǎo)金葡菌結(jié)合纖維蛋白原。研究發(fā)現(xiàn)凝集因子A能促進(jìn)血漿中的細(xì)菌聚集，并使金葡菌黏附在導(dǎo)管、受損的血管壁和心臟瓣膜，從而導(dǎo)致感染性心內(nèi)膜炎發(fā)生。動物實驗發(fā)現(xiàn)，與未接種組相比，接種凝集因子A疫苗組小鼠感染金葡菌后體質(zhì)量下降緩慢，化膿性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度較輕（P＜0.006），30 d后病死率亦較低（13%和47%）。進(jìn)一步研究表明，注射凝集因子A抗體能有效降低化膿性關(guān)節(jié)炎以及膿毒血癥的病死率（37%和78%，P＜0.003）［5］。然而凝集因子A在臨床試驗中的結(jié)果卻并不樂觀。Aurexis○R是對凝集因子A有高效親和力的抗體，一項有60例血流感染患者參與Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素聯(lián)合Aurexis○R（20 mg／kg）治療并未明顯降低血流感染復(fù)發(fā)率、并發(fā)癥以及病死率［6］。Veronate○R是基于凝集因子A和絲氨酸天冬氨酸重復(fù)蛋白G的多克隆IgG抗體，Ⅱ期臨床試驗證實，注射高劑量Veronate○R的新生兒感染發(fā)生率較低（2.5%和7.0%），但隨后在膿毒癥患者的Ⅲ期臨床試驗中，抗體注射組和安慰劑組感染發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（6%和5%，P＞0.05）［4］。因此，凝集因子 A 疫苗和抗體的應(yīng)用時機(jī)和劑量選擇需要更多臨床研究。

（二）鐵調(diào)控表面決定因子 金葡菌的鐵調(diào)控表面決定因子抗原可攝取和轉(zhuǎn)運宿主血紅蛋白和肌紅蛋白中的鐵元素，在鐵缺乏的環(huán)境中其表達(dá)增加。哺乳動物的組織和血液是低鐵環(huán)境，在金葡菌感染時鐵調(diào)控表面決定因子抗原表達(dá)上調(diào)［7］。Ebert等［7］研究表明，金葡菌感染前2 h注射鐵調(diào)控表面決定因子B抗體可有效發(fā)揮預(yù)防作用，使膿毒癥小鼠生存率增高（P＝0.004）；在中央靜脈導(dǎo)管模型中，注射鐵調(diào)控表面決定因子B抗體可以減少細(xì)菌在導(dǎo)管上定植，降低血流感染發(fā)生率；但其治療作用不明顯，感染1 h后注射抗體僅輕微改善小鼠生存率（P＝0.30）。Merck V710○R是針對鐵調(diào)控表面決定因子B的臨床疫苗，多中心、雙盲Ⅰ期臨床試驗證實，注射30～90μg該疫苗10～14 d后，志愿者體內(nèi)可發(fā)生抗菌免疫應(yīng)答［8］，但Ⅱ／Ⅲ期臨床試驗結(jié)果分析顯示，Merck V710○R沒有明顯的保護(hù)作用，并且患者病死率和多器官功能障礙發(fā)生率較高，因而目前已終止對 Merck V710○R的研究（www.european pharmaceuticalreview.com／7547／news）。

二、針對細(xì)菌毒素和毒素分泌機(jī)制的免疫療法

在感染過程中，由金葡菌分泌到細(xì)胞外的毒素也在其致病中發(fā)揮重要作用，因此通過中和細(xì)胞外毒素以及調(diào)控毒素分泌等方式可降低金葡菌的致病性。目前在金葡菌中研究較多的有a－溶血素、超抗原家族中的腸毒素和中毒性休克毒素、殺白細(xì)胞素［4］，這些毒力因子的分泌主要受到附屬基因調(diào)節(jié)（agr）群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。

（一）a－溶血素 金葡菌分泌的a－溶血素是促進(jìn)細(xì)胞溶解的成孔毒素。Adhikari等［9］研究發(fā)現(xiàn)，基于a－溶血素結(jié)構(gòu)的AT－62aa疫苗可以使小鼠感染金葡菌后血流感染以及肺炎發(fā)生率明顯降低（P＜0.05），減少細(xì)菌播散以及膿毒癥的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，注射AT62－IgG抗體可有效中和毒素，抑制a－溶血素聚合體形成，感染12 h后小鼠血液、脾臟、腎臟和肺組織中細(xì)菌負(fù)荷量下降；AT－62aa對膿毒血癥和肺炎預(yù)防作用的臨床試驗正在進(jìn)行中。

（二）超抗原家族 金葡菌的腸毒素和中毒性休克毒素等超抗原可以通過抗原提成細(xì)胞與T細(xì)胞受體交聯(lián)偶合，導(dǎo)致T細(xì)胞增殖以及大量細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致中毒性休克綜合征的發(fā)生。研究表明，靈長類動物暴露于金葡菌腸毒素B氣溶膠后可引起胃腸道癥狀、嗜睡、休克甚至死亡。注射金葡菌腸毒素B抗體可起到免疫保護(hù)作用［10］。Hu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，免疫接種滅活中毒性休克毒素－1疫苗可提高感染小鼠生存率并降低各組織器官中細(xì)菌負(fù)荷量；注射中毒性休克毒素－1抗體可抑制INF－γ和TNF－α等致病因子的表達(dá)。目前，金葡菌腸毒素B疫苗在中毒休克綜合征中的預(yù)防作用的Ⅰ期臨床試驗（NCT00974935）正在進(jìn)行中（http：／／clinicaltrials.gov／ct2／show／NCT00974935）。

（三）殺白細(xì)胞素 殺白細(xì)胞素由LukS和LukF蛋白組成，是能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞溶解的成孔毒素，研究發(fā)現(xiàn)CA－MRSA分泌的殺白細(xì)胞素與皮膚和軟組織感染相關(guān)。Brown等［12］研究發(fā)現(xiàn)，殺白細(xì)胞素疫苗在小鼠肺炎和皮膚感染中發(fā)揮保護(hù)作用。但在臨床試驗中，Hermos等［13］研究發(fā)現(xiàn)，殺白細(xì)胞素抗體在兒童初次或復(fù)發(fā)的皮膚軟組織感染中并不能起到保護(hù)作用，甚至可能增加感染風(fēng)險。

（四）agr群體感應(yīng)系統(tǒng) 金葡菌agr群體感應(yīng)系統(tǒng)可調(diào)控多種毒素和胞外酶的表達(dá)，合成并釋放群體感應(yīng)分子自體誘導(dǎo)肽（AIPs）可以監(jiān)測自身濃度以及周圍環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量變化，當(dāng)達(dá)到一定濃度閾值時，能啟動菌體中相關(guān)致病基因表達(dá)。近年來，agr系統(tǒng)及AIPs被作為免疫治療靶點。研究表明AIPs－4的單克隆抗體AP4－24H11可以降低agr效應(yīng)分子RNAⅢ表達(dá)，使金葡菌致病性下降，抑制小鼠膿腫形成，并提高感染小鼠生存率［14］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，agr抑制劑在下調(diào)某些毒力因子的同時可上調(diào)某些agr反向調(diào)控因子如SpA的表達(dá)，造成金葡菌黏附定植能力以及生物被膜的形成增加［15］。因此，目前agr抑制劑的應(yīng)用尚存在爭議，關(guān)于agr系統(tǒng)在金葡菌中的致病機(jī)制和能否作為免疫治療靶點仍需進(jìn)一步研究。

三、針對莢膜多醣體的免疫療法

包裹金葡菌的莢膜可阻礙抗體和金葡菌表面蛋白的接觸，從而限制抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用，臨床菌株中5型和8型莢膜多糖最常見。動物實驗發(fā)現(xiàn)采用單價5型莢膜多糖疫苗免疫小鼠，感染后實驗組存活率明顯高于磷酸鹽緩沖鹽水接種組（73%和13%）［4］。采用5型莢膜多糖或8型莢膜多糖抗體治療的小鼠感染4 d后各種組織內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷量均明顯降低（P＜0.001）［16］。目前，針對莢膜多糖體的臨床研究結(jié)果尚有爭議。StaphVAX○R是基于5型莢膜多糖、8型莢膜多糖的疫苗，研究發(fā)現(xiàn)Staph－VAX○R可使血液透析患者金葡菌血流感染的發(fā)生率下 降 57%［4］；AltaStaph○R是針對 StaphVAX○R的抗體，206例低體質(zhì)量新生兒分別給予AltaStaph○R和安慰劑治療，結(jié)果兩組血流感染的發(fā)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；另外一項Ⅱ期臨床實驗，40例血流感染且持續(xù)高熱患者隨機(jī)分組給予AltaStaph○R和標(biāo)準(zhǔn)治療，兩組的病死率分別為23%和11%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.42）［15］。

四、針對ABC運載體的免疫療法

ABC運載體是位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間或者內(nèi)膜中的一類保守脂蛋白，主要參與細(xì)菌營養(yǎng)物質(zhì)攝取和生物被膜的形成，并參與抗菌藥物泵出機(jī)制使細(xì)菌耐藥性增強。Brady等［17］在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，采用ABC運載體疫苗聯(lián)合萬古霉素治療慢性骨髓炎，臨床感染癥狀和影像學(xué)感染表現(xiàn)分別下降67%和82%，其中87.5%的生物膜可以被完全清除，而單獨使用抗菌藥物或疫苗均不能有效清除感染。Ⅱ期臨床試驗中證實ABC運載體抗體Aurograb○R

可以增加金葡菌對萬古霉素的敏感性，但是在治療難治性金葡菌感染的Ⅲ期試驗中，Aurograb○R聯(lián)合萬古霉素治療沒有達(dá)到預(yù)期療效［15］。

五、針對脂磷壁酸的免疫療法

脂磷壁酸是革蘭陽性菌獨有的等離子膜鑲嵌聚合體。早期研究表明，脂磷壁酸可以與CD14和TLR2受體結(jié)合，激活NF－κB通路，在關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及腎炎的致病中發(fā)揮重要作用。研究表明，采用脂磷壁酸抗體可以促進(jìn)血流感染中細(xì)菌清除，減少腹膜炎模型中小鼠的病死率［18］。Pagibaximab○R是針對脂磷壁酸的疫苗，Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗證實其可以降低低體質(zhì)量新生兒血流感染的發(fā)生率［19］。目前評估 Pagibaximab○R對金葡菌膿毒血癥的防治作用的Ⅱ／Ⅲ期試驗已完成。

六、針對 N－乙酰－B－1，6－葡萄糖胺（PNAG）的免疫療法

金葡菌分泌的細(xì)胞外PNAG與生物膜的形成有關(guān)，可使致病菌逃避中性粒細(xì)胞的吞噬作用以及抗菌肽殺菌作用［20］。研究結(jié)果顯示，注射脫乙?；鵓NAG的兔血清抗體可以使小鼠血液中金葡菌清除率達(dá)到54%～91%［4］。目前PNAG抗體在銅綠假單胞菌等耐藥菌感染中的保護(hù)作用已得到證實［21］。

動物實驗中，以金葡菌細(xì)胞壁相關(guān)黏附蛋白、毒力因子等為靶點的免疫療法可以降低金葡菌定植和感染。但是，目前尚無任何一種疫苗或抗體成功通過臨床試驗并應(yīng)用于臨床，這可能與多種因素有關(guān)［4，10］。首先，金葡菌抗原靶點的選擇仍是現(xiàn)在面臨的一大挑戰(zhàn)，細(xì)菌生長的不同階段抗原表達(dá)不同且易發(fā)生改變；同種感染的不同時相發(fā)揮主要致病作用的抗原也不同；對于不同類型的感染，致病的關(guān)鍵抗原亦不同，如a－溶血素和殺白細(xì)胞素較容易引起肺炎和皮膚軟組織感染，而PNAG主要與有生物膜形成的慢性感染相關(guān)。其次，金葡菌具有復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制。金葡菌分泌的免疫調(diào)控蛋白具有抑制補體激活、中性粒細(xì)胞趨化、抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用以及中和抗菌防御肽等作用，如超抗原蛋白7、10可與IgA和IgG結(jié)合，抑制補體激活；此外金葡菌可持續(xù)存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)菌，逃避宿主的免疫應(yīng)答。

七、結(jié)語

對于金葡菌感染，尤其抗菌藥物治療無效的多重耐藥菌感染，越來越多的證據(jù)顯示，疫苗主動免疫預(yù)防或抗體被動免疫治療是一種可行的補充或替代治療方法。因此，了解金葡菌復(fù)雜的致病因素與宿主免疫應(yīng)答之間相互作用機(jī)制，尋找相對保守的免疫治療靶點仍是今后努力研究的方向。此外，研制具有廣譜靶點的疫苗和抗體［22］，針對金葡菌所致不同部位的感染，以及不同罹患人群選擇合適的免疫療法，可能使未來免疫治療取得成功。

［1］ 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等.2011年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12（5）：321－329.

［2］ Brink AJ.Does resistance in severe infections caused by methicillin－resistant Staphylococcus aureus give you the′creeps′？［J］.Curr Opin Crit Care，2012，18（5）：451－459.

［3］ Ythier M，Resch G，Waridel P，et al.Proteomic and transcriptomic profiling of Staphylococcus aureus surface LPXTG－proteins：correlation with agr genotypes and adherence phenotypes［J］.Mol Cell Proteomics，2012，11（11）：1123－1139.

［4］ Verkaik NJ，van Wamel WJ，van Belkum A.Immunotherapeutic approaches against Staphylococcus aureus ［J］.Immunotherapy，2011，3（9）：1063－1073.

［5］ Josefsson E，Hartford O，O′Brien L，et al.Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A，a novel virulence determinant［J］.J Infect Dis，2001，184（12）：1572－1580.

［6］ Weems JJ Jr，Steinberg JP，F(xiàn)iller S，et al.Phase II，randomi－zed，double－blind，multicenter study comparing the safety and pharmacokinetics of tefibazumab to placebo for treatment of Staphylococcus aureus bacteremia［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（8）：2751－2755.

［7］ Ebert T，Smith S，Pancari G，et al.A fully human monoclonal antibody to Staphylococcus aureus iron regulated surface determinant B（IsdB）with functional activity in vitro and in vivo［J］.Hum Antibodies，2010，19（4）：113－128.

［8］ Harro C，Betts R，Orenstein W，et al.Safety and immunogenicity of a novel Staphylococcus aureus vaccine：results from the first study of the vaccine dose range in humans［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17（12）：1868－1874.

［9］ Adhikari RP，Karauzum H，Sarwar J，et al.Novel structurally designed vaccine for S.aureus alpha－h(huán)emolysin：protection against bacteremia and pneumonia［J］.PLoS One，2012，7（6）：e38567.

［10］ Proctor RA.Is there a future for a Staphylococcus aureus vaccine？［J］.Vaccine，2012，30（19）：2921－2927.

［11］ Hu DL，Omoe K，Sasaki S，et al.Vaccination with nontoxic mutant toxic shock syndrome toxin1 protects against Staphylococcus aureus infection［J］.J Infect Dis，2003，188（5）：743－752.

［12］ Brown EL，Dumitrescu O，Thomas D，et al.The Panton－Valentine leukocidin vaccine protects mice against lung andskin infections caused by Staphylococcus aureus USA300［J］.Clin Microbiol Infect，2009，15（2）：156－164.

［13］ Hermos CR，Yoong P，Pier GB.High levels of antibody to panton－valentine leukocidin are not associated with resistance to Staphylococcus aureus－associated skin and soft－tissue infection［J］.Clin Infect Dis，2010，51（10）：1138－1146.

［14］ Park J，Jagasia R，Kaufmann GF，et al.Infection control by antibody disruption of bacterial quorum sensing signaling［J］.Chem Biol，2007，14（10）：1119－1127.

［15］ Ohlsen K，Lorenz U.Immunotherapeutic strategies to combat staphylococcal infections［J］.Int J Med Microbiol，2010，300（6）：402－410.

［16］ Tuchscherr LP，Buzzola FR，Alvarez LP，et al.Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small－colony variants of Staphylococcus aureus in mice［J］.Infect Immun，2008，76（12）：5738－5744.

［17］ Brady RA，O′May GA，Leid JG，et al.Resolution of Staphylococcus aureus biofilm infection using vaccination and antibiotic treatment［J］.Infect Immun，2011，79（4）：1797－1803.

［18］ Theilacker C，Kropec A，Hammer F，et al.Protection against Staphylococcus aureus by antibody to the polyglycerolphosphate backbone of heterologous lipoteichoic acid［J］.J Infect Dis，2012，205（7）：1076－1085.

［19］ Weisman LE，Thackray HM，Garcia－Prats JA，et al.Phase 1／2 double－blind，placebo－controlled，dose escalation，safety，and pharmacokinetic study of pagibaximab （BSYXA110），an antistaphylococcal monoclonal antibody for the prevention of staphylococcal bloodstream infections，in verylow－birth－weight neonates［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53（7）：2879－2886.

［20］ Park B，Liu GY.Targeting the host－pathogen interface for treatment of Staphylococcus aureus infection［J］.Semin Immunopathol，2012，34（2）：299－315.

［21］ Ricard JD.New therapies for pneumonia［J］.Curr Opin Pulm Med，2012，18（3）：181－186.

［22］ Pozzi C，Wilk K，Lee JC，et al.Opsonic and protective properties of antibodies raised to conjugate vaccines targeting six Staphylococcus aureus antigens［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46648.