抗鴨坦布蘇病毒病卵黃抗體的制備及應用試驗

胡紫霞，王漢清，王 立 ，殷冬冬，占松鶴 ，王楠楠，朱良強，王桂軍

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036；2.安徽省動物疫病預防與控制中心，安徽合肥 230031）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）引起的蛋鴨和種鴨一種急性傳染病，病鴨以采食量和產(chǎn)蛋率急劇下降并伴有淘汰和死亡為特征[1-2]。該病自2010年首次在我國發(fā)現(xiàn)以來，目前在各蛋鴨場和種鴨場均有不同程度地發(fā)生，已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的疾病之一。據(jù)調(diào)查，該病一旦發(fā)生流行，鴨群內(nèi)發(fā)病率幾乎為100%，產(chǎn)蛋率下降30%～60%，死淘率最高可達20%～30%，而且發(fā)病鴨群整體均勻度降低，抗病力下降，易繼發(fā)感染其它細菌性疾病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-6]。

鴨坦布蘇病毒病發(fā)病急，傳播迅速，目前尚無有效的疫苗可用，藥物治療效果也不理想，臨床上較難控制[7]。本研究以鴨坦布蘇病毒AH-F10株滅活免疫制劑多次免疫高產(chǎn)蛋雞，制備抗坦布蘇病毒高免卵黃抗體，經(jīng)臨床初步應用，對鴨坦布蘇病毒病具有良好的預防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 鴨坦布蘇病毒AH-F10株由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室分離鑒定，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號CCTC V2012013；鴨坦布蘇病毒瓊擴檢測抗原由本制備；SPF雞胚由本實驗室孵化器孵化10日齡用于實驗；高產(chǎn)蛋雞為合肥市某雞場飼養(yǎng)的130日齡健康羅曼商品代蛋雞，用于免疫接種鴨坦布蘇病毒免疫制劑，制備高免卵黃抗體；3周齡櫻桃谷商品代雛鴨購自安徽某種鴨場，且種鴨坦布蘇病毒抗體陰性；瓊脂糖、氯仿、硫酸銨等為國產(chǎn)分析純。

1.2 鴨坦布蘇病毒滅活免疫制劑的制備 取鴨坦布蘇病毒AH-F10株接種10日齡SPF雞胚增殖培養(yǎng)，收集接毒后84h左右死亡的雞胚尿囊液，經(jīng)甲醛滅活作為水相與白油及乳化劑按一定比例進行乳化，制成油包水型乳劑滅活免疫制劑。經(jīng)無菌檢驗和安全檢驗合格后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫高產(chǎn)蛋雞 用上述制備的滅活免疫制劑免疫130日齡健康高產(chǎn)羅曼商品蛋雞60只，首次經(jīng)頸部皮下注射免疫，免疫劑量為0.8mL/只。分別間隔2周進行第2次和第3次免疫，免疫劑量為1.5mL /只，免疫途徑相同。第3次免疫10d后進行第4次免疫，免疫劑量為2mL/只，于頸部和胸部皮下多點注射。

1.4 卵黃抗體制備 在第4次免疫后1周開始收獲雞蛋，測定卵黃中的鴨坦布蘇病毒瓊擴抗體效價。收集瓊擴抗體效價達1∶32以上的雞蛋作為高免蛋制備卵黃抗體。將高免蛋用自來水清洗污物后浸泡于0.05%百毒殺10min，然后用紗布擦干后晾干。用75% 酒精棉球進行蛋殼表面消毒，無菌操作打開蛋殼，分蛋清，將蛋黃倒入消毒玻璃燒杯內(nèi)備用。將卵黃和滅菌生理鹽水按1∶4的比例稀釋，在高速組織搗碎機中2000 r / min 勻漿5 min，加青霉素、鏈霉素各1000 U / mL，然后按0.01%加入硫柳汞，分裝于滅菌玻璃瓶中，加塞密封并標記，置室溫立即進行純化或置于-20℃冰箱備用[8-9]。

1.5 卵黃抗體純化 取上述粗制卵黃抗體，加入1倍體積的氯仿，充分振蕩后，4000r/min.離心20min.，收集上層水相，加入飽和硫酸銨使其終濃度為50%，4℃靜置1 h，5000r/min.離心20min.，棄上清，用與原卵黃抗體等體積的滅菌生理鹽水溶解沉淀，加入飽和硫酸銨，使其終濃度為30%，5000r/min.離心20min.，棄上清，用與原卵黃抗體體積相等的0.01mol/L的PBS（pH7.4）溶解沉淀，透析24h，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]。

1.6 純化卵黃抗體的無菌檢驗、效價測定和安全檢驗 在無菌條件下，分別取0.2mL上述純化的卵黃抗體接種鮮血瓊脂平板和厭氧肉湯平板中，37℃培養(yǎng)48h，觀察細菌生長情況；采用瓊脂擴散方法檢測純化卵黃抗體的瓊擴效價；安全檢驗，取健康雛鴨16只隨機分為2組，一組為試驗組，腿部肌注純化的卵黃抗體1mL/只，另一組為對照組，腿部肌注生理鹽水1mL/只，連續(xù)觀察雛鴨狀況72h，72h后剖檢雛鴨，觀察心、肝、脾、腦等器官有無病理變化。

1.7 卵黃抗體對雛鴨的保護力檢驗 將3周齡健康雛鴨30只，適應性飼養(yǎng)1周后隨機分成A、B和C 3個組，每組10只。A組鴨腿部肌注純化卵黃抗體0.5mL/只，B、C組作對照。24h后，將A和B組鴨分別經(jīng)腿部肌注AH-F10毒株0.5mL/只，C組鴨經(jīng)腿部肌注滅菌生理鹽水0.5mL/只。將3組雛鴨隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察1周，觀察雛鴨發(fā)病和死亡情況。

1.8 卵黃抗體對成年鴨的治療試驗 從某養(yǎng)鴨戶購買186日齡健康產(chǎn)蛋麻鴨20只，人工感染AHF10毒株0.5mL/只，觀察感染鴨采食、飲水、產(chǎn)蛋和精神狀態(tài)，待出現(xiàn)精神不振、采食減少時，肌注上述純化卵黃抗體2mL/只，每日1次，連續(xù)注射3天。連續(xù)2周，觀察試驗鴨的采食和產(chǎn)蛋量恢復狀況。

2 結(jié)果

2.1 卵黃抗體檢測結(jié)果 無菌條件下，純化卵黃抗體在鮮血瓊脂平板和厭氧肉湯平板37℃培養(yǎng)48h后，均無細菌生長，菌檢均為陰性。采用瓊脂擴散方法檢測純化卵黃抗體的瓊擴效價達1∶32以上，純化卵黃抗體與抗原之間出現(xiàn)清晰致密的沉淀帶。安全檢驗結(jié)果為：試驗組和對照組雛鴨均未呈現(xiàn)異常癥狀，72h后對16只雛鴨進行解剖，結(jié)果表明與對照組相比，試驗組雛鴨心、肝、脾、腦均未呈現(xiàn)任何病理變化，說明制備的卵黃抗體安全性良好。

2.2 卵黃抗體對雛鴨的保護力檢驗 注射抗體后進行AH-F10攻毒的A組有1只雛鴨在攻毒第2天出現(xiàn)減食和腹瀉癥狀，第5天恢復正常，觀察期內(nèi)未見死亡。觀察1周后捕殺，均無肉眼可見病變。沒有注射純化卵黃抗體的B組雛鴨，經(jīng)AH-F10毒株攻毒第3天均出現(xiàn)精神沉郁，減食，腹瀉、拉綠色稀糞，喜臥，并伴有輕度神經(jīng)性癥狀。觀察期內(nèi)死亡8只，解剖見腦膜、肝臟、胰腺出血，腸道腫大。對照組C組雛鴨一直保持良好精神狀態(tài)，試驗期間均未見發(fā)病、死亡，1周后后捕殺均無肉眼可見病變。表明制備的卵黃抗體對抗雛鴨坦布蘇病毒病有良好的保護效果。

2.3 卵黃抗體對成年鴨坦布蘇病毒的治療效果 試驗鴨從鴨場購買回來隔離飼養(yǎng)，人工感染鴨坦布蘇病毒病后3天，部分試驗鴨出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少，所有鴨停止產(chǎn)蛋。應用本實驗室的制備純化的抗鴨坦布蘇病毒抗體緊急治療，注射后第2天采食量略有回升，精神狀態(tài)略有好轉(zhuǎn)。治療第4天，1周后鴨群的采食基本恢復正常，部分鴨開始產(chǎn)蛋。結(jié)果表明，應用該卵黃抗體能有效控制產(chǎn)蛋鴨坦布蘇病毒病，對感染產(chǎn)蛋鴨的采食量和產(chǎn)蛋率的恢復有良好的治療效果。

3 小結(jié)和討論

3.1 卵黃抗體因其具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、產(chǎn)量高的優(yōu)點，已廣泛用于生物及醫(yī)學領域，在家禽、家畜及人類疾病診斷與防治方面應用廣泛，對病毒性疾病治療更是具有獨特優(yōu)勢[11]。利用異源動物制備高免卵黃抗體，具有動物種系發(fā)生距離優(yōu)勢，更適于產(chǎn)生特異性抗體，具有良好開發(fā)前景。應用卵黃抗體治療動物傳染病方面研究已有不少報道[12，13]，尤其在預防和治療一些家禽急性傳染病如鴨病毒性肝炎、雞傳染性法氏囊病等發(fā)揮重要的作用[11，14]。

3.2 鴨坦布蘇病毒病是近年來在我國出現(xiàn)的鴨急性傳染病，目前自然發(fā)生該病主要引起種鴨和蛋鴨的產(chǎn)蛋下降。鴨坦布蘇病毒AH-F10株是本實驗室從安徽發(fā)病鴨場分離到的，經(jīng)人工攻毒試驗發(fā)現(xiàn)其對雛鴨也有較強的致病性，并引起雛鴨死亡。因此，本研究用雛鴨人工攻毒試驗來觀察卵黃抗體對鴨坦布蘇病毒病的預防和治療作用。在當前尚沒有有效的疫苗預防的情況下，采用卵黃抗體預防和控制鴨坦布蘇病毒有著積極意義。

3.3 對正處于高產(chǎn)的種鴨和蛋鴨一旦暴發(fā)鴨坦布蘇病毒病，產(chǎn)蛋率在短時間內(nèi)急劇下降，在沒有繼發(fā)感染情況下，一般2～4周流行自行結(jié)束，采食量和產(chǎn)蛋率逐步恢復。由于沒有特效藥物治療，不少養(yǎng)鴨場在發(fā)病期間使用利巴韋林、黃芪多糖、金剛烷胺等抗病毒藥物來治療鴨坦布蘇病毒病。從治療效果來看并不理想，而且發(fā)病期間使用抗病毒藥物的鴨場在流行結(jié)束后產(chǎn)蛋率的恢復更為緩慢，因而，應用高免卵黃抗體對特異性地預防和治療鴨坦布蘇病毒病，對鴨群產(chǎn)蛋率的恢復有較好的促進作用。

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