我國豬瘟病毒基因流行變異研究

郝 飛 湯德元＊ 曾智勇 李春燕

羅險(xiǎn)峰2 甘振磊1 劉 建1 王洪光1

（1貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州省貴陽市 550025；2貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州省貴陽市 550008）

豬瘟 （Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒 （Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種以高熱、出血和高死亡率為特征的接觸性傳染病[1]?？筛腥靖鞣N年齡和品種的豬只[2]，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，被世界衛(wèi)生組織（OIE）列入必須申報(bào)的動(dòng)物傳染病目錄，我國將其列為一類動(dòng)物傳染病。在我國廣泛地應(yīng)用豬瘟兔化弱毒疫苗免疫后，豬瘟的發(fā)生和流行得到了有效的控制。近年來，我國的豬瘟疫情有反彈趨勢(shì)，因此了解豬瘟病毒疫苗毒與流行毒株之間的差異，對(duì)于豬瘟的防制十分重要。目前，我國對(duì)豬瘟病毒的流行病學(xué)研究主要集中在對(duì)流行毒株基因群 （基因亞群）的劃分和對(duì)豬瘟病毒主要保護(hù)性抗原基因 （E0、E2基因）的變異分析。因此，豬瘟病毒基因流行變異情況的研究對(duì)于我國豬瘟的防制乃至凈化有著重要的意義。

1 豬瘟的基因分群

國際上將豬瘟病毒分為3個(gè)基因群，即基因Ⅰ群 （GroupⅠ）、基因Ⅱ群（GroupⅡ） 和基因Ⅲ群 （GroupⅢ）， 在這3個(gè)大群下面又細(xì)分了10個(gè)基因亞群，分別為 1.1亞群 （Subgroup 1.1）、1.2亞群 （Subgroup 1.2）、 1.3亞群（Subgroup 1.3）、 2.1 亞群 （Subgroup 2.1）、 2.2 亞群 （Subgroup 2.2）、 2.3 亞群 （Subgroup 2.3）、 3.1亞群 （Subgroup 3.1）、 3.2 亞群 （Subgroup 3.2）、 3.3 亞群 （Subgroup 3.3） 和3.4亞群 （Subgroup 3.4）[3]。我國豬瘟病毒流行毒株主要分為CSFV基因Ⅰ群和基因Ⅱ群，且以基因Ⅱ群為主，各流行毒株亞群分布介于Subgroup 1.1、Subgroup 2.1、Subgroup 2.2和Subgroup 2.3亞群，占主導(dǎo)地位的是Subgroup 2.1和Subgroup 2.2。20世紀(jì)分離的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Shimen株及以其為母本致弱的兔化弱毒株HCLV株均屬Subgroup 1.1。到目前為止，我國尚未有Subgroup 1.2、Subgroup 1.3和基因Ⅲ群毒株的報(bào)道。

1.1 CSFV E2基因分群

豬瘟病毒E2基因參與病毒對(duì)細(xì)胞的感染過程，攜帶能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原決定簇，E2蛋白是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原。研究E2基因和蛋白的變異對(duì)制定豬瘟防控策略具有十分重要的意義。王琴等[4]在對(duì)不同時(shí)期分離到的12株豬瘟毒株的E2基因主要抗原區(qū)域序列研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代到90年代在我國流行的豬瘟病毒在基因Ⅰ群和Ⅱ群均有分布，其中屬Ⅰ群的有1株20世紀(jì)80年代的野毒株和5株20世紀(jì)90年代的野毒株，屬Ⅱ群的有6個(gè)野毒株 （20世紀(jì)80年代與90年代的野毒株各3株）。趙耘等[5]將獲得的16株豬瘟病毒的E2基因主要抗原編碼區(qū)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)Shimen株和C株同屬Ⅰ群中的Subgroup 1.1；4株20世紀(jì)70年代到80年代的分離株有1株屬于Ⅰ群的Subgroup 1.1，其余3株均屬于Ⅱ群的Subgroup 2.1；10株20世紀(jì)90年代的分離株有5株屬于I群中的Subgroup 1.1，4株屬于 Subgroup 2.1，l株屬于Subgroup 2.2。測(cè)定的14個(gè)流行株有6株屬Ⅰ群，占42.9%，8株屬Ⅱ群，占57.1%。吳健敏等[6]從廣西8個(gè)地市13個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)采集的疑似豬瘟病料中擴(kuò)增并測(cè)定了CSFV基因部分序列，進(jìn)化樹分析表明，廣西的豬瘟病毒流行株基因群分布于2個(gè)基因群的4個(gè)亞群 （即Subgroup 1.1、Subgroup 2.1、Subgroup 2.2和Subgroup 2.3），其中交通不發(fā)達(dá)的邊遠(yuǎn)地區(qū)流行毒株以Ⅰ群中的Subgroup 1.1為主，而交通發(fā)達(dá)地區(qū)流行毒株以Ⅱ群為主。說明我國豬瘟流行毒株存在明顯的遺傳多樣性和明顯的地域特征。涂長(zhǎng)春[7]測(cè)定了全國30個(gè)省、市、自治區(qū)191個(gè)豬瘟病毒流行株E2基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這191株豬瘟病毒流行毒株分為2個(gè)基因群，基因Ⅰ群毒株占26%，基因Ⅱ群占74%。在主要流行的基因Ⅱ群毒株中，以Subgroup 2.1為主，Subgroup 2.2和Subgroup 2.3的流行態(tài)勢(shì)較弱。我國流行的所有Ⅰ群毒株均為Subgroup 1.1，而且大部分毒株與Shimen株序列同源性很高，推測(cè)其可能是在中國流行幾十年的本土病毒。但在這些序列中未發(fā)現(xiàn)基因Ⅲ群毒株，表明在周邊國家，如韓國和泰國等地區(qū)流行的基因Ⅲ群毒株尚未傳入我國。

1.2 CSFV E0基因分群

E0基因 （Erns基因）在豬瘟病毒對(duì)細(xì)胞的感染及在細(xì)胞中的復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控中起著重要作用。其編碼的E0蛋白是豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能夠分泌到侵染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的囊膜糖蛋白，具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力，同時(shí)具有RNA酶活性，能降解病毒和細(xì)胞的RNA，還可導(dǎo)致免疫抑制，是豬瘟病毒的毒力蛋白和保護(hù)性抗原。劉湘濤等[8]對(duì)5株1997～1998年間甘肅省豬瘟流行毒株和l株豬瘟蘭州C株弱毒疫苗毒E0基因進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明5株流行毒株均屬于基因Ⅱ群。王琴等[9]對(duì)10個(gè)豬瘟野毒株、4批不同廠家生產(chǎn)的兔化弱毒疫苗株及1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Shimen株E0基因的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析，結(jié)果表明這些毒株分為Ⅰ和Ⅱ兩大基因群及4個(gè)亞群，間接說明我國豬瘟病毒的變異呈現(xiàn)一定多樣性。

2 豬瘟病毒流行變異研究

豬瘟病毒的基因變異決定了其遺傳多樣性，為了進(jìn)一步探明其變異規(guī)律，進(jìn)而明確導(dǎo)致毒株分群的氨基酸變異位點(diǎn)，國內(nèi)許多學(xué)者對(duì)我國豬瘟病毒的分子流行病學(xué)現(xiàn)狀進(jìn)行了遺傳衍化分析。

2.1 CSFV E2基因流行變異研究

李紅衛(wèi)等[10]首先在國內(nèi)開展了豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒弱毒株和少數(shù)流行株E2基因序列的測(cè)定與比較，對(duì)國內(nèi)3個(gè)獸醫(yī)生物制品廠提供的豬瘟病毒兔化弱毒株E2基因保護(hù)性抗原編碼區(qū)序列進(jìn)行研究，并與國內(nèi)Shimen株和國外C株相同區(qū)域進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)不同來源的C株和Shimen株之間存在不同程度的差異，從而推測(cè)不同來源C株的抗原表位存在差異，最終可能會(huì)導(dǎo)致免疫效果不同。王寧等[11]研究發(fā)現(xiàn)Shimen株與國內(nèi)使用的疫苗毒株同源性最低，說明國內(nèi)疫苗毒株的E2基因在生產(chǎn)中存在較大變異，可能導(dǎo)致抗原漂移。劉伯華等[12]對(duì)6株甘肅省豬瘟流行野毒及C株細(xì)胞疫苗毒E2基因的核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明流行野毒與C株在中和抗原決定簇上有部分氨基酸存在性質(zhì)差異，可能影響C株對(duì)流行野毒的中和滴度，但也有學(xué)者持相反的觀點(diǎn)。王琴等[4]對(duì)12株豬瘟病毒E2基因主要抗原區(qū)域的序列差異進(jìn)行了分析，初步證明我國應(yīng)用的疫苗株HCLV是穩(wěn)定的。利用目前我國流行的部分野毒株對(duì)HCLV株免疫豬攻毒試驗(yàn)顯示，免疫豬只對(duì)野毒株具有較高抵抗力，與序列分析結(jié)果相吻合，表明了HCLV株E2基因主要編碼區(qū)沒有發(fā)生關(guān)鍵的變異。韓雪清等[13]研究發(fā)現(xiàn)C株兔化組織毒適應(yīng)異種細(xì)胞后其抗原區(qū)的變異很小甚至沒有變異，經(jīng)常發(fā)生的C株細(xì)胞毒疫苗免疫失敗現(xiàn)象可能并非由疫苗毒抗原基因漂移所致。

涂長(zhǎng)春[5]對(duì)3個(gè)基因型共9個(gè)亞型的177個(gè)序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了如下規(guī)律：在基因組E2蛋白編碼區(qū)內(nèi)，第734位Lys(K)→Arg(I)，723位Ser(S)→Asn(N)，745位 Thr(T)→Ile(I)導(dǎo)致Subgroup 2.1的出現(xiàn)，738位Thr(T) →Ile(I)導(dǎo)致Subgroup 2.2的出現(xiàn)，736位Ile(I)→Val(V)導(dǎo)致Subgroup 2.3的出現(xiàn)，725位Gly(G)→Asp(D)， 729位 Asp(D)→Asn(N)，738位Thr(T)→Val(V)導(dǎo)致Subgroup 1.1的出現(xiàn)。趙耘等[14]對(duì)22株豬瘟病毒E2基因部分編碼序列的分析表明，我國豬瘟病毒流行毒株向著遠(yuǎn)離疫苗株的方向變異，且呈現(xiàn)一定多樣性。李明暉等[15]對(duì)4株甘肅省1997～1998年間流行毒株的E2基因序列分析表明，CSFV流行毒株與C株的E2蛋白之間存在一定的差異。鄧雨修等[16]擴(kuò)增了3株廣東省近年來流行的豬瘟病毒E2基因，發(fā)現(xiàn)與Shimen株同源性為82.3%～93%，表明近年來豬瘟流行毒株的變異呈現(xiàn)一定的多樣性。楊林等[17]研究發(fā)現(xiàn)黑龍江省6株豬瘟流行株均為經(jīng)典毒株，與HCLV、Shimen毒株E2基因核苷酸同源性分別為92.4%～95.5%、92.6%～96.1%，氨基酸同源性分別為 90.7%～95.0%、91.9%～96.3%。馬秋明等[18]研究發(fā)現(xiàn)陜西省l0株豬瘟流行毒株與Shimen株和HCLV疫苗株E2基因主要抗原區(qū)的核苷酸同源性為75.0%～79.4%，氨基酸同源性為77.8%～84.4%，說明陜西省豬瘟流行株發(fā)生了較大變異。以上研究表明，我國廣西地區(qū)的CSFV流行毒株E2基因也呈現(xiàn)較為明顯的變異。

綜上表明，我國不同地區(qū)豬瘟流行毒株的差異情況較為復(fù)雜，主要趨向于遠(yuǎn)離疫苗株變異，同時(shí)又存在和Shimen株等同源性較高的經(jīng)典毒株流行。

2.2 CSFV E0基因流行變異研究

李紅衛(wèi)等[19]研究發(fā)現(xiàn)從第480代豬瘟兔化弱毒株 （HCLV）脾毒中擴(kuò)增出的E0基因與C株相應(yīng)序列的核苷酸、氨基酸序列同源性分別為99.1%和98.4%。王家富等[20]研究發(fā)現(xiàn)中國獸藥監(jiān)察所第482代兔化脾組織毒（HCLV）和Shimen強(qiáng)毒株E0基因序列核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為95.0%和94.3%，HCLV株比Shimen株多了一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，且有13個(gè)氨基酸的差異。龔振華等[21]將流行株XN株的E0基因分別與 Shimen、C株相應(yīng)序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)他們的核苷酸同源性分別為99%和95%。

E0糖蛋白有4個(gè)保守區(qū)域，氨基酸位點(diǎn)分別為21～43位、71～94位，123～141位、154～182位。其中28～40位，71～89位的氨基酸是 E0糖蛋白R(shí)Nase活性區(qū)（催化活性的氨基酸為His30、His79）。對(duì)多株毒株研究表明，E0糖蛋白第107位氨基酸變異較大，HCLV株為Val，Brescia株為Set，Shimen株和ALD株為Ala，GPE株和Alfort株為Asp，推測(cè)該位置氨基酸的高度變異可能與其抗原決定簇的特異性有關(guān)。劉湘濤等[8]對(duì)豬瘟流行毒株E0基因的遺傳變異進(jìn)行了研究，完成了1997～1998年間5株豬瘟流行毒株和1株C株E0基因的核酸序列測(cè)定。序列分析表明這5株流行毒株與C株的核苷酸同源性為83%～84%，流行毒株與疫苗株之間有較大差異，而5株流行毒之間的核苷酸同源性為91%～98%，差異較小。在RNase活性基序中，C株和5株流行毒株有一個(gè)氨基酸存在差異，C株含不帶電荷的Gly(G)，5株流行毒株均含 Glu(E)，經(jīng)典強(qiáng)毒株 SM、A1fort、Brescia株和P97株也都含 Glu(E)，但這一差異對(duì)催化活力有無影響尚不明確。王琴等[9]將10株豬瘟野毒株、4批不同廠家生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒疫苗株和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)豬瘟SM株進(jìn)行E0基因序列同源性比較分析，結(jié)果表明15株毒株 E0基因核苷酸同源性為83.0%～100%，氨基酸同源性為87.9%～100%。4批兔化弱毒疫苗株相對(duì)穩(wěn)定，僅存在1～2個(gè)氨基酸殘差異。15株毒株E0基因具有RNase活性的2個(gè)區(qū)域SLHGlWPG(E)和EWNKHGWC均十分保守，但疫苗毒SLHGIWPE基序中的E替換為G，而基序中His30、His79催化活性關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守，均未發(fā)生變異。

由此可見，我國豬瘟病毒流行毒株主要分為豬瘟病毒基因Ⅰ群和基因Ⅱ群，且以基因Ⅱ群為主，通過對(duì)豬瘟病毒E0基因序列分析表明，流行株與疫苗株相比雖然發(fā)生了一定程度的變異，但是在RNase活性關(guān)鍵位點(diǎn)高度保守，未出現(xiàn)變異，而通過對(duì)E2基因序列分析表明，我國豬瘟病毒的流行毒株正在向遠(yuǎn)離豬瘟兔化弱毒疫苗株 （HCLV株）方向變異。

[1]Moennig V.Introduction to classical swine fever virus,disease and control policy.Vet Microbiol,2000,73(2-3)：93-102.

[2]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué).（第2版）.北京：科學(xué)出版社，1997，645-667.

[3]PatonD J,McGoldrick A,Grieser-Wilkeltet I,et al.Genetictyping of classical swine fever virus.Vet Microbiol,2000,73(2-3)：137-157.

[4]王琴，王在時(shí)，趙耘，等.12株豬瘟病毒E2基因主要抗原區(qū)域的序列差異分析.微生物學(xué)報(bào)，2000，40（6）：614-621.

[5]趙耘，王在時(shí)，王琴，等.23株豬瘟病毒E2基因主要抗原編碼區(qū)序列差異分析.中國獸醫(yī)科技，2002，32（3）：3-7.

[6]吳健敏，蔣冬福，韋志峰，等.廣西豬瘟流行現(xiàn)狀的調(diào)查分析.中國獸醫(yī)科技，2002，32（2）：16-18.

[7]涂長(zhǎng)春.中國豬瘟流行病學(xué)現(xiàn)狀與防制研究.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[8]劉湘濤，韓雪清，劉伯華，等.豬瘟流行野毒Erns基因的序列分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（4）：75-81.

[9]王琴，寧宜寶，王在時(shí)，等.豬瘟病毒流行株與疫苗株Erns基因的序列分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（3）：446-452.

[10]李紅衛(wèi)，涂長(zhǎng)春，呂宗吉，等.異源豬瘟病毒C株E2基因保護(hù)性抗原編碼區(qū)的序列分析與比較.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18（2）：112-114．

[11]王寧，傅烈振，張楚瑜，等.豬瘟病毒石門株E2基因序列分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32（1）：74-78.

[12]劉伯華，劉湘濤，韓雪清，等.急慢性豬瘟病毒分離株和疫苗株E2基因的序列分析.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，32（6）：568-575.

[13]韓雪清，李紅衛(wèi)，劉湘濤，等.中國豬瘟兔化弱毒株（C株）兔脾組織毒主要保護(hù)性抗原E2（gp55）基因序列分析.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，32（1）：52-57.

[14]趙耘，王在時(shí)，王琴，等.22株豬瘟病毒E2基因部分編碼序列的序列分析.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（5）：42-48.

[15]李明暉，劉湘濤，韓雪清，等.4株豬瘟流行野毒株病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2基因的核苷酸序列分析.中國獸醫(yī)科技，2001，31 （5）：8-10.

[16]鄧雨修，宋延華，王東東，等.廣東省豬瘟流行野毒E2基因的擴(kuò)增及其序列分析.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2008，33（2）：29-31.

[17]楊林，趙德明.豬瘟病毒黑龍江流行毒株E2基因序列分析.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（4）：68-70.

[18]馬秋明，張建安，王強(qiáng)，等.陜西省豬瘟病毒流行毒株E2基因變異分析初報(bào).西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，35（5）：19-23.

[19]李紅衛(wèi)，劉湘濤，李小兵，等.我國豬瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列測(cè)定. 中國病毒學(xué)，1999，14（2）：169-173.

[20]王家富，張楚瑜，王寧，等.豬瘟病毒石門株與兔化弱毒株E0糖蛋白基因的克隆及序列分析.微生物學(xué)報(bào)，2000，40 （1）：32-37.

[21]龔振華，王鈺璇，劉珅，等.一株豬瘟病毒田間株E0蛋白基因的克隆和序列分析的研究.中國動(dòng)物檢疫，2007，24（1）：22-24.