AKT信號通路與干細(xì)胞增殖

王碧涵，楊萬章

1 絲氨酸／蘇氨酸激酶（AKT）信號通路概述

PI3－K／AKT信號通路最早被發(fā)現(xiàn)在胰島素刺激及其應(yīng)答的調(diào)控中起重要作用。隨著研究的深入和下游底物的不斷發(fā)現(xiàn)，PI3－K／AKT信號通路作為一條非常重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被人們所認(rèn)識。激素、生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分和應(yīng)激等多種因素刺激后，AKT信號通路被活化，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長與存活，細(xì)胞增殖與凋亡，細(xì)胞的遷移、分化及糖類代謝等的調(diào)控中扮演重要角色。AKT執(zhí)行的復(fù)雜功能，主要是通過磷酸化一系列特異性下游底物完成的。近年來對AKT信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞的增殖影響AKT及其下游信號分子的磷酸化表達水平，這提示AKT信號系統(tǒng)在調(diào)控干細(xì)胞的增殖中起著重要的作用。

1.1 AKT的結(jié)構(gòu) AKT屬于AGC蛋白激酶家族[1]，已經(jīng)被證實是PI3－K／AKT信號通路的中心介導(dǎo)蛋白7年，Staal等[2]在小鼠的反轉(zhuǎn)錄病毒AKT8中找到一個癌基因，命名為v－AKT7年，3個獨立的研究小組[3－5]先后成功克 隆出AKT基因，發(fā)現(xiàn)它是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，并認(rèn)為AKT可能在酪氨酸和絲氨酸／蘇氨酸磷酸化途徑中形成功能聯(lián)系。AKT作為一種相對分子質(zhì)量約60×103（60KD）的胞內(nèi)信號蛋白，因其激酶結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）具有高度同源性，故又被稱為蛋白激酶B（PKB）。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)的AKT家族至少包括三種亞型：AKT1，AKT2和AKT3，也被稱為PKBα，PKBβ和PKBγ。AKT1在真核細(xì)胞中廣泛表達，主要調(diào)控細(xì)胞存活和增殖；AKT2在胰島素敏感組織中高度表達（如肌肉、脂肪組織），參與胰島素調(diào)節(jié)的代謝過程；而AKT3則主要分布在腦和睪丸組織，調(diào)節(jié)細(xì)胞的大小以及數(shù)目[6]。它們在結(jié)構(gòu)上具有高度的同源性和保守性，其分子由氨基末端PH結(jié)構(gòu)域、羧基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（包含疏水基）和中間的激酶催化結(jié)構(gòu)域組成，含有thr308、thr450、Ser473和Ser124四個磷酸化調(diào)節(jié)位點，其中thr308（位于催化結(jié)構(gòu)域）和Ser473（位于調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的疏水基）的磷酸化與AKT活化有關(guān)，并且雙位點磷酸化才能使AKT完全激活。

1.2 AKT信號通路的調(diào)節(jié) AKT是PI3－K／AKT信號通路中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其活化依賴于PI3－K，因此研究中多以磷酸化的 AKT（p－AKT）作為衡量 PI3－K 活性的指標(biāo)。PI3－K（phosphoinositide 3－kinase，磷脂酰肌3－激酶），是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)和底物的不同可以分為三型，其中Ⅰ型P13－K參與生長因子和細(xì)胞因子激活的信號通路應(yīng)答，主要介導(dǎo)細(xì)胞的生存、增殖、分化等生物學(xué)功能[7]。Ⅰ型PI3－K是一種包含催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的異源二聚體，其中調(diào)節(jié)亞基由三個基因編碼，有五種亞型：p85α，p55α，p50α，p85β和 p55γ；催化亞基有三種亞型，p110α，p110β和p110δ，分別由不同基因編碼。胰島素或者生長因子等配體激活受體酪氨酸激酶（RTKs），或者G－蛋白偶聯(lián)受體受刺激后均能使P13－K磷酸化。在活化的PI3－K作用下，細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）被磷酸化而轉(zhuǎn)換成磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的AKT因而被募集到細(xì)胞膜并通過氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域和PIP3結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象改變，PDK1（3－phosphatide－dependent kinase，磷脂酰激酶依賴激酶1）得以靠近、催化AKT的thr308磷酸化。但是AKT的完全活化還需要Ser473的磷酸化，后者的磷酸化相對復(fù)雜，研究者們曾經(jīng)推測其磷酸化調(diào)節(jié)可能與一種假想的名為PDK2的激酶有關(guān)，但實際上后來的研究證明依據(jù)刺激和環(huán)境的不同[8，9]，參與催化該位點的酶是 mTORC2或者 DNA－PK。AKT完全激活后進一步介導(dǎo)其下游信號的級聯(lián)反應(yīng)，參與調(diào)控細(xì)胞的存活、增殖、遷移、分化以及其他細(xì)胞代謝活動。隨著研究的深入，越來越多的蛋白分子被鑒定為AKT信號通路的特異性下游底物，包括目前研究較多的：促凋亡因子BAD、胱天冬蛋白酶9（caspase－9），促凋亡轉(zhuǎn)錄因子Forkhead家族，促生存信號NF－κB，雷帕霉素（mTOR）以及與糖代謝有關(guān)的糖原合成激酶－3（GSK－3）等。

PTEN則是AKT信號通路中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，通過將PIP3去磷酸化為PIP2來實現(xiàn)對PI3－K的負(fù)調(diào)節(jié)，此外，PP2A和PHLPP1／2分別通過誘導(dǎo)thr308、Ser473的去磷酸化而使 AKT鈍化，也起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[10]。人工合成的LY294002是PI3－K的特異性抑制劑，通過阻斷PI3－K而實現(xiàn)對PI3－K／AKT信號通路的抑制。

2 AKT信號通路在干細(xì)胞增殖中的作用

干細(xì)胞可以分為三類：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞；依據(jù)其所處的發(fā)育階段則分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。近年來干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)研究方面顯示出廣闊的臨床應(yīng)用前景，成為其中最前沿，最具活力和影響力的研究領(lǐng)域之一[11]。

盡管自我更新和增殖是干細(xì)胞的固有性質(zhì)，但目前對調(diào)控其增殖的信號通路及分子機制并不完全清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)AKT信號通路及其下游蛋白的磷酸化表達水平可能決定著干細(xì)胞的命運，在維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)、調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新和增殖中起關(guān)鍵作用。

2.1 胚胎干細(xì)胞 1998年James等首次成功建立了人胚胎干細(xì)胞系，將人卵體外受精培育至早期胚泡，提取內(nèi)細(xì)胞群，最終得到了5個人胚胎干細(xì)胞系[12]。然而，胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增時極易分化為其他細(xì)胞，限制了干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用。

早在1999年，Sun等[13]在研究小鼠胚胎干細(xì)胞時就發(fā)現(xiàn)，PTEN基因缺陷的細(xì)胞完成一個細(xì)胞分裂周期的時間較正常時減少5%～10%。這項研究第一次使人們認(rèn)識到PI3－K／AKT信號通路可能在胚胎干細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。隨后的研究進一步證實了這個發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用PI3－K特異性抑制劑LY294002處理后，胚胎干細(xì)胞的增殖減慢，細(xì)胞富集于G1期[14]。周睿卿等[15]以胎鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，二維培養(yǎng)的方法培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞并觀察其生長狀態(tài)，以飼養(yǎng)層細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞K562細(xì)胞株作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人胚胎干細(xì)胞在未分化狀態(tài)時Pten抑制的PI3－K／AKT／mTOR信號通路下游磷酸化關(guān)鍵蛋白活性較低。研究者推測，PI3－K／AKT／mTOR信號通路在胚胎干細(xì)胞的自我復(fù)制和分化中起到重要作用，更由此猜想如果抑制負(fù)調(diào)節(jié)蛋白PTEN或直接激活該通路正調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白，可能會加快人胚胎干細(xì)胞增殖、減少凋亡。

2.2 成體干細(xì)胞 腦缺血等損傷可以激活成年大腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，促使其增殖、產(chǎn)生新的神經(jīng)元并向損傷部位募集，這種現(xiàn)象在側(cè)腦室外側(cè)壁的室管膜下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回顆粒下層（SGZ）尤其明顯[16，17]。但是這種調(diào)控機制至今仍未完全闡明，研究表明微環(huán)境的改變、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等可能都參與其中7年，Kitagawa等首次報導(dǎo)在永久性大鼠大腦中動脈缺血模型中觀察到PI3－K／AKT信號通路的激活，這提示AKT信號通路可能在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖方面起作用[18]。隨后的大量研究證實這種內(nèi)源性的干細(xì)胞增殖調(diào)控涉及多條信號通路，其中由生長因子激活的PI3－K／AKT信號通路可能在干細(xì)胞生長、存活以及增殖中扮演重要角色[19－21]。這在趙宇等[22]體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞實驗中也得到證實，應(yīng)用不同濃度梯度的PI3－K特異性抑制劑LY294002孵育后進行細(xì)胞存活、增殖等檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LY294002阻斷AKT信號通路呈劑量依賴性，且隨著濃度升高，p－AKT含量降低，大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。

此外，有關(guān)AKT信號通路參與其他成體干細(xì)胞如心臟干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等增殖調(diào)控的相關(guān)報道也有許多。成熟的心臟組織中仍然存在少量干細(xì)胞，有研究表明其數(shù)量只占正常心肌細(xì)胞的1%[23]。趙嵐等[24]證實，心肌梗死同樣促進內(nèi)源性心臟干細(xì)胞增殖，PI3－K／AKT信號通路參與了大鼠心肌梗死后心臟干細(xì)胞的動員調(diào)節(jié)。在大鼠冠脈阻塞模型中觀察到，急性缺血誘導(dǎo)局部心肌AKT表達水平和干細(xì)胞數(shù)量同步進行性升高，AKT抑制劑顯著抑制上述各項指標(biāo)的動態(tài)演變，使心肌梗死面積進一步惡化。Gharibi等[25]利用血小板源生長因子受體β體外培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P13－K／AKT／mTOR以及下游相關(guān)蛋白p70S6K和4E－BP1與干細(xì)胞增殖調(diào)控有關(guān)，另一條信號通路ERK則介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。Perry等[26]揭示 Wnt（β）－catenin和 PI3－K／AKT 信號通路的共同作用下，造血干細(xì)胞才能實現(xiàn)自我更新和擴增。

同樣有研究報導(dǎo)稱AKT信號通路與干細(xì)胞的分化密切相關(guān)。Isomoto等[27]應(yīng)用 mTOR特異性抑制劑rapamycin阻斷PI3－K／AKT／mTOR信號通路后發(fā)現(xiàn)成骨分化受抑制，這提示PI3－K／AKT／mTOR信號通路的活化與成骨前體細(xì)胞即間充質(zhì)干細(xì)胞的分化有關(guān)。國海東等[28]研究表明在骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（BMP－2）誘導(dǎo)的骨髓源性心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中，PI3－K／AKT信號通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。成體干細(xì)胞在發(fā)育過程中，既要維持自我增殖，又要進一步分化為各種類型細(xì)胞，在其分化和增殖之間應(yīng)該存在著一種平衡調(diào)節(jié)機制，可能AKT信號通路正是這種平衡途徑之一。

3 AKT信號通路與腫瘤發(fā)生

近年來AKT信號通路與腫瘤發(fā)生的關(guān)系也日益受到人們的關(guān)注。AKT的過度表達或者PTEN等負(fù)調(diào)控機制的失活與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中可以檢測到該通路信號蛋白及其調(diào)節(jié)分子的異常表達[29，30]。蔓小紅等[31]研究發(fā)現(xiàn)，尖銳濕疣和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中PI3－K／AKT信號通路被異常激活，HPV有可能通過影響PI3K和P－AKT的表達上調(diào)進而引起感染上皮的異常增殖。研究已經(jīng)證實PI3－K／AKT信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移，目前以該通路及其關(guān)鍵分子為治療靶點的腫瘤治療新策略也成了研究熱點。張輝等[32]的研究表明，AKT激酶在前列腺癌生長、發(fā)展以及激素依賴性向激素非依賴性的轉(zhuǎn)變過程中起著重要作用。p－AKT蛋白磷酸化水平在AKT磷酸化激活過程中占主導(dǎo)地位，是AKT激活的必要過程。米非司酮抑制前列腺癌PC－3細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制可能是通過抑制AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而激活Caspase。

4 中醫(yī)中藥

最近天津中醫(yī)藥大學(xué)的一個研究小組從傳統(tǒng)中藥丹參中提取出了45種活性成分[33]，一一檢測其對于體外培養(yǎng)的神經(jīng)干／祖細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)能力，篩選結(jié)果提示丹酚酸B對神經(jīng)干／祖細(xì)胞具有促進增殖作用，并且這種促進作用呈時間－劑量依賴關(guān)系，其調(diào)控的分子機制可能與PI3－K／AKT信號通路有關(guān)；動物實驗也證實丹酚酸B可以通過干預(yù)PI3－K／AKT信號通路介導(dǎo)短暫性腦缺血大鼠模型大腦神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和增殖。丹參抗肝纖維化的作用已經(jīng)被證實，丹參的水溶性有效成分丹參素具有保護肝細(xì)胞，顯著抑制肝星狀細(xì)胞增殖并促進其凋亡的作用[34]。王玨等[35]研究提示不同濃度的丹參素和渥曼青霉素作用于肝星狀細(xì)胞24h后，細(xì)胞中磷酸化AKT（p－Akt）表達隨藥物濃度增加表達逐漸減弱，這說明丹參素和渥曼青霉素對肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用與其抑制PI3－K／Akt信號通路中AKT的活化有關(guān)。賴真等[36]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可刺激PI3－K／AKT信號通路的表達，減輕大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

5 展 望

目前的研究揭示AKT信號通路參與了干細(xì)胞的自我更新和增殖調(diào)控，未來研究的一個方向極有可能以此為調(diào)控靶點，篩選藥物，提高干細(xì)胞的增殖率，進而為干細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)提供更多的細(xì)胞來源，使干細(xì)胞療法在“不治之癥”的治療方面得到更廣泛的應(yīng)用。Jun等[37]研究發(fā)現(xiàn)，原釩酸鈉通過干預(yù)AKT和ERK信號通路促進中風(fēng)大鼠大腦SVZ區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。由此推測，原釩酸鈉可能因此成為治療腦中風(fēng)的潛在藥物。但是這種調(diào)控機制是非常復(fù)雜的，可能不止涉及一條信號通路，而是多條通路的相互作用、相互影響。有關(guān)干細(xì)胞增殖的精確調(diào)控機制以及胞內(nèi)信號通路間的相互作用尚有待進一步的研究證實。

小鼠AKT基因敲除實驗表明PI3－K／AKT信號通路的正常表達維持細(xì)胞的生存、代謝和分化，但是AKT的持續(xù)異?；罨閷?dǎo)的抗凋亡、促增殖等作用卻與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。由此可知AKT信號通路是一把雙刃劍，如何控制干細(xì)胞的增殖和分化，真正使基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用，不僅需要更加廣泛深入的研究，更需要慎重的科學(xué)態(tài)度。

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