中藥干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展1）

趙彥超，顧 耘

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種與脂質(zhì)代謝異常、血栓形成及遺傳環(huán)境等因素相關(guān)的疾病過(guò)程。細(xì)胞凋亡存在于AS中已為許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，并被認(rèn)為是AS病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。細(xì)胞凋亡直接影響血管內(nèi)血栓形成、粥樣硬化動(dòng)脈的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及斑塊的穩(wěn)定性。因而研究中藥干預(yù)細(xì)胞凋亡、保護(hù)心血管，已成為當(dāng)今心血管藥物研究的一個(gè)新方向。

1 對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響

細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為至少有三條通路參與，即線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。

1.1 線粒體通路 又稱(chēng)內(nèi)源性凋亡途徑，線粒體通路可由多種因素誘發(fā)，如細(xì)胞脫離了原來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境、失去了賴(lài)以生存的生長(zhǎng)因子、DNA損傷等[2]。在生理情況下，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（MPTP）周期性開(kāi)放，防止膜間隙正離子的過(guò)度蓄積。在各種促細(xì)胞凋亡信號(hào)作用下，MPTP不可逆過(guò)度開(kāi)放，線粒體跨膜電位崩解，細(xì)胞色素c（Cytc）等促凋亡活性蛋白釋放至胞漿內(nèi)，Cytc與凋亡蛋白酶活化因子－1（Apaf－1）形成多聚復(fù)合體，活化Caspase－9前體，導(dǎo)致下游效應(yīng)者Caspase－3活化，切割底物使細(xì)胞凋亡[3]。這一途徑中，活性Caspase－3是級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白酶[4]，Bcl－2家族是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者，他們通過(guò)激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用。紅花黃色素B[5]、茶多酚[6]、麝香酮[7]均能有效抑制細(xì)胞線粒體膜電位損傷后細(xì)胞內(nèi)鈣超載，維護(hù)線粒體功能，提高線粒體膜電位（MMP），抑制刺激對(duì)細(xì)胞線粒體的損傷作用導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。高培國(guó)等[8]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，葛根素可通過(guò)拮抗過(guò)氧化氫對(duì)線粒體膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保持線粒體膜的完整性，維持線粒體膜電位，減少線粒體損傷率，降低Caspase－3陽(yáng)性表達(dá)率，阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。李響等[9]研究表明，注射用血栓通可以防止線粒體損傷，提高Bcl－2表達(dá)水平，減少Cytc的釋放，減低Caspase－3活性來(lái)拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。蒙果等[10]研究發(fā)現(xiàn)金鈉多中所含銀杏黃酮可以阻止MMP的下降和保持膜的完整性，從而抑制線粒體Cytc釋放和細(xì)胞凋亡發(fā)生。

1.2 死亡受體通路 該途徑也稱(chēng)外源性凋亡途徑，死亡受體中最典型的是Fas和TNFRs。①Fas／FasL死亡通路：FasL可與Fas結(jié)合，募集FADD（Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）后形成了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活Procaspase－8，進(jìn)一步自我激活啟動(dòng)下游的Caspase相關(guān)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。該通路中，DISC的形成是級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟[11]。②TNFR死亡通路：TNFRs當(dāng)與TNF結(jié)合后，TNFR－I三聚體化，然后募集一個(gè)銜接蛋白 TRADD（TNFR－associated death domain）。TRADD可以引起兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，①通過(guò)招募FADD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；②通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白2（TRAF－2）和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（RIP）活化。TRAF－2和 RIP活化NF－κB誘導(dǎo)激酶（NIK），NIK使IκB發(fā)生磷酸化，并促進(jìn) NF－κB的降解和釋放，后者轉(zhuǎn)位至核，激活一系列基因表達(dá)[12]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。甄艷軍等[13]實(shí)驗(yàn)顯示，木賊提取物能致血管平滑?。⊿MC）膜表面Fas大量表達(dá)，增加死亡受體與配體結(jié)合的細(xì)胞毒作用介導(dǎo)SMC的凋亡，而且凋亡率與Fas、FasL表達(dá)量成正相關(guān)，兩者結(jié)合觸發(fā)的凋亡效應(yīng)可清除增生的SMC，減輕內(nèi)膜增生，使AS早期SMC增殖與凋亡趨于平衡，減輕AS早期病變。尚秀玲[14]予白藜蘆醇干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化家兔，結(jié)果顯示白藜蘆醇能明顯降低家兔主動(dòng)脈FasmRNA、FasLmRNA、Caspase－3mRNA表 達(dá)，且 Caspase－3mRNA 表 達(dá) 與 FasmRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，通過(guò)抑制Fas／FasL途徑來(lái)抗AS斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡。林蓉等[15]研究槲皮素對(duì)TNF－α損傷的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，TNF－α使ECV核內(nèi)NF－κB表達(dá)增加，而槲皮素能降低內(nèi)皮細(xì)胞NF－κB的表達(dá)，抑制其活化，減少其降解和釋放。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是指很多病理生理刺激，如氧化應(yīng)激、缺血缺氧、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂及病毒感染等，能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊與錯(cuò)誤折疊蛋白蓄積以及Ca2＋平衡紊亂。適度的ERS可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白等降低損傷；而持久或嚴(yán)重的ERS則可引起細(xì)胞凋亡[16]。目前，已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑有3條：①CHOP／GADD153基因的激活轉(zhuǎn)錄；②JNK的激活通路；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase－12的激活通路[17]。其中，CHOP通路是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的主要通路。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78）作為一種分子伴侶在蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，通過(guò)“異常折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)”途徑激活ERS[18]，魏晏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)淫羊霍苷（ICA）預(yù)處理的同型半胱氨酸（HCY）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)GRP78mRNA表達(dá)明顯減少，且未見(jiàn)明顯凋亡形態(tài)學(xué)改變，考慮減緩血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是ICA抗細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制之一。高雪等[20]以體外培養(yǎng)HUVECs，通過(guò)Ang－Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，觀察鹽酸川芎嗪（TMP·HCl）對(duì)凋亡細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)Ang－Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞很快激活細(xì)胞內(nèi)ERK1／2、JNK，引起細(xì)胞損傷。予鹽酸川芎嗪預(yù)保護(hù)的細(xì)胞ERK和JNK磷酸化程度隨藥物濃度增高而降低，其激活程度與TMP·HCl濃度成反比。表明TMP·HCl能抑制ERK、JNK的信號(hào)通路來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

2 對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白的作用

Caspase家族和Bcl－2家族在凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著舉足輕重的作用。Caspases家族是凋亡活化因子，是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，是凋亡通路的核心執(zhí)行者。Bcl－2家族蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件，分為3類(lèi)：促凋亡蛋白，如Bak和Bax；抗凋亡蛋白，如 Bcl－2和 Bcl－xL 以及 Bim、Bid等 BH3－only蛋白，BH3－only是一類(lèi)促凋亡蛋白，通過(guò)抑制Bcl－2抗凋亡成員的活性或激活Bax／Bak樣促凋亡成員的活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。王燕[21]研究發(fā)現(xiàn)，用含硒29.403mg／kg的富硒大蒜油能夠降低Bax和Caspase－3蛋白表達(dá)量，使Bcl－2蛋白表達(dá)量顯著升高，通過(guò)作用于基因轉(zhuǎn)錄水平逆轉(zhuǎn)Bax、Bcl－2和Caspase－3的蛋白表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。郭峰等[22]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)迷迭香酸預(yù)處理可以增加凋亡細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達(dá)，減少Bax蛋白的表達(dá)，升高Bcl－2／Bax的蛋白比值，降低Fas、FasL的蛋白表達(dá)。潘露茜等[23]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，軟脈煎可以從蛋白水平調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，軟脈煎干預(yù)后細(xì)胞Caspase－8蛋白表達(dá)顯著降低，提示軟脈煎能通過(guò)干預(yù)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中的多信號(hào)途徑介質(zhì)Caspase－8來(lái)抑制凋亡。嚴(yán)玉平等[24]應(yīng)用烏雞白鳳丸治療動(dòng)脈粥樣硬化大鼠研究發(fā)現(xiàn)，Caspase－3蛋白表達(dá)下調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率降低，增殖指數(shù)增加。何煜舟[25]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木犀草素抑制H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑涉及Caspase－3通路。該藥可顯著抑制Caspase－3陽(yáng)性表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量。

3 結(jié) 語(yǔ)

從細(xì)胞凋亡角度探討中藥干預(yù)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)，無(wú)論是對(duì)凋亡的誘發(fā)因素，還是信號(hào)傳導(dǎo)通路及調(diào)控蛋白的研究都取得一定的成就，涉及的藥物包括中藥提取出的單體、有效成分以及單味藥和復(fù)方制劑。但是中藥抗細(xì)胞凋亡的分子學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，其藥理學(xué)基礎(chǔ)涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，因而目前仍存在著不足。①細(xì)胞凋亡系統(tǒng)本身分子機(jī)制未能闡明的十分透徹，因而中藥對(duì)各凋亡傳導(dǎo)通路作用的研究大多只停留在表面，更深層次的研究很少。②中藥本身成分的復(fù)雜，使得其作用多靶點(diǎn)、多層次，大部分研究只顯示中藥對(duì)細(xì)胞凋亡的有效性，而有效成分及凋亡作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。③目前大部分實(shí)驗(yàn)研究為單因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡體外實(shí)驗(yàn)，且處于初步試驗(yàn)階段，不能真正地模擬相應(yīng)體內(nèi)病變及中藥干預(yù)的全面情況，人體是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，因而在體內(nèi)多因素參與下中藥對(duì)細(xì)胞凋亡的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機(jī)制是需要研究和完善的重點(diǎn)。④從目前對(duì)凋亡研究的中藥來(lái)看，以活血藥物居多，呈現(xiàn)了藥物研究的局限性。

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