腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)

李世通，肖順，章淑玲，周 峽，張紹升

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)(Ditylenchus destructor Thorne)是農(nóng)作物上重要的病原線(xiàn)蟲(chóng)，主要為害馬鈴薯塊莖和甘薯塊根.在我國(guó)，腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)主要引起甘薯糠心病，一般可導(dǎo)致其減產(chǎn)20%－50%，重者則達(dá)80%以上，甚至絕收，在儲(chǔ)藏期還可引起爛窖［1－2］.研究表明，腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)可與尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)在甘薯上形成顯著的復(fù)合侵染;茄病鐮孢(F.solani)也可以通過(guò)莖線(xiàn)蟲(chóng)造成的傷口侵染，加重甘薯病害的發(fā)生［3］.研究腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、遺傳特點(diǎn)及防治技術(shù)等都需要大量的線(xiàn)蟲(chóng)群體，因此，掌握能夠大量培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的方法是非常必要的.用真菌培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)量大，是目前常用的培養(yǎng)方法.已報(bào)道的可培養(yǎng)莖線(xiàn)蟲(chóng)的真菌有鏈格孢菌(Alternaria spp.)、鐮刀菌(Fusarium spp.)、彎孢霉菌(Curvularia spp.)、葡萄孢菌(Botrytis spp.)、絲核菌(Rhizoctonia spp.)等［4］.本試驗(yàn)采用長(zhǎng)柄鏈格孢(A.longipes)和茄病鐮刀菌培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)，旨在篩選出適合培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的真菌.

1 材料與方法

1.1 材料

2011年9月，從河北省遷安市甘薯田中采集感染糠心病的薯塊和根際土壤.長(zhǎng)柄鏈格孢和茄病鐮刀菌均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 方法

1.2.1 線(xiàn)蟲(chóng)的分離 將采集到的薯塊沖洗干凈，切成小塊，然后采用改良貝曼漏斗法［4］分離，收集得到莖線(xiàn)蟲(chóng)，并在顯微鏡下剔除其他線(xiàn)蟲(chóng).

1.2.2 真菌的培養(yǎng) 用18 mm×150 mm的試管制作PDA斜面(約10 mL)，在PDA斜面上分別接種長(zhǎng)柄鏈格孢和茄病鐮刀菌，在26℃的恒溫箱中培養(yǎng)，至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)斜面.

1.2.3 線(xiàn)蟲(chóng)的消毒與培養(yǎng) 取滅菌的玻片，分別滴上1滴無(wú)菌水和1滴0.1%氯霉素溶液.挑取分離純化的線(xiàn)蟲(chóng)20條，在無(wú)菌水中清洗1次，然后挑入0.1%氯霉素溶液中，再用移液槍將含有線(xiàn)蟲(chóng)的氯霉素溶液移入PDA斜面的菌絲上.每種真菌做6個(gè)重復(fù).將斜面放入27℃恒溫箱中培養(yǎng)60 d.

1.2.4 線(xiàn)蟲(chóng)的計(jì)數(shù)與統(tǒng)計(jì)分析 培養(yǎng)60 d后，將試管中的線(xiàn)蟲(chóng)用無(wú)菌水沖洗到滅菌的50 mL離心管中，離心并吸掉上清液，定容至7 mL，充分震蕩使線(xiàn)蟲(chóng)在水中分布均勻.用20 μL移液槍分別吸取10滴線(xiàn)蟲(chóng)混合液，滴至載玻片上，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，并估算出線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù).用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

在27℃黑暗條件下，2種真菌培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)出一定的差異.從外觀上看，長(zhǎng)柄鏈格孢的菌絲濃密，在接種線(xiàn)蟲(chóng)后菌絲變得濕潤(rùn)(圖1A)，這是被線(xiàn)蟲(chóng)取食的典型現(xiàn)象;在倒置顯微鏡下觀察，線(xiàn)蟲(chóng)在試管壁聚集成密集的線(xiàn)蟲(chóng)網(wǎng)群(圖1C).茄病鐮刀菌的菌絲較稀薄，也有被線(xiàn)蟲(chóng)取食的典型現(xiàn)象(圖1B);在倒置顯微鏡下觀察，線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量比較少，試管壁上聚集成的線(xiàn)蟲(chóng)網(wǎng)較稀薄(圖1D).

圖1 2種真菌培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的外觀差異Fig.1 Appearance differences of D.destructor cultured by two fungi

統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)表明:在27℃黑暗條件下培養(yǎng)60 d，在長(zhǎng)柄鏈格孢上的最大培養(yǎng)量為35000條·管－1，最小為21000條·管－1，平均26800條·管－1;在茄病鐮刀菌上的最大培養(yǎng)量為6230條·管－1，最小為3360 條·管－1，平均4853 條·管－1.

表1 2種真菌培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量Table 1 Number of D.destructor cultured by two fungi

3 討論

Young et al［5］在1995年培養(yǎng)了從人參根上分離到的腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)，確定最佳培養(yǎng)溫度為20℃.但我國(guó)的報(bào)道指出，該線(xiàn)蟲(chóng)的最佳生長(zhǎng)繁殖溫度為27－28℃［2，4］.這可能是由線(xiàn)蟲(chóng)種群的差異所導(dǎo)致.本試驗(yàn)選用27℃培養(yǎng)線(xiàn)蟲(chóng).

用真菌培養(yǎng)莖線(xiàn)蟲(chóng)的報(bào)道很多.Young et al［5］、徐進(jìn)軍等［6］報(bào)道了茄病鐮刀菌是比較好的培養(yǎng)材料;劉斌等［7］報(bào)道在三角瓶中用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌對(duì)該線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)效果很好;林茂松［8］報(bào)道用毛殼菌可以培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng).在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)利用長(zhǎng)柄鏈格孢培養(yǎng)腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)效果很好，適合該線(xiàn)蟲(chóng)的大量培養(yǎng).該真菌具有兩大優(yōu)點(diǎn):(1)易于培養(yǎng)，生長(zhǎng)迅速，采用多點(diǎn)接種，3 d即可長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)斜面;(2)菌絲濃密，適宜大量線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖.

在接種方面，采用無(wú)菌水清洗1次后，連同線(xiàn)蟲(chóng)消毒液一起滴在菌絲上.這樣既簡(jiǎn)化了操作步驟，又能防止細(xì)菌的污染，且對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)和真菌的影響不大.

［1］劉維志.植物線(xiàn)蟲(chóng)志［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004:69－71.

［2］段玉璽.植物線(xiàn)蟲(chóng)學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2011:172－175.

［3］章淑玲，張紹升.甘薯莖線(xiàn)蟲(chóng)與鐮孢菌對(duì)甘薯的復(fù)合侵染［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，36(4):361－364.

［4］張紹升.植物線(xiàn)蟲(chóng)病害診斷與治理［M］.福州:福建省科學(xué)技術(shù)出版社，1999:73－156.

［5］YOUNG H K，SEUNG H O.In vitro culture and factors affecting population changes of Ditylenchus destructor of ginseng［J］.Korean Journal of Plant Pathology，1995，11(1):39－46.

［6］徐進(jìn)軍，李世東，楊之為.馬鈴薯莖線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13(4):77－80.

［7］劉斌，鄭經(jīng)武.腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)單異活體繁殖方法研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18(6):445－447.

［8］林茂松.室內(nèi)人工接種測(cè)定甘薯品種對(duì)馬鈴薯腐爛線(xiàn)蟲(chóng)的抗性［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，12(3):44－47.