胎盤源間充質(zhì)干細胞的分子生物學(xué)特性

王敬龍 金巨樓 杜冰 毛智 王樹平 劉志輝

胎盤來源的間充質(zhì)干細胞（placenta derived mesenchymal stem cell，PMSC）是近幾年來受到學(xué)者普遍關(guān)注的一種新的成體干細胞。胎盤，這一在胎兒娩出后被“廢棄”的人體器官，不僅來源豐富、取材方便、產(chǎn)婦知情同意后無倫理限制，而且具有造血支持及免疫抑制等諸多優(yōu)點，使PMSC成為間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）中倍受關(guān)注的一種。隨著對PMSC研究的深入，筆者發(fā)現(xiàn)其分離培養(yǎng)方法多種多樣，莫衷一是，對其生物學(xué)性狀的闡述也不盡相同。鑒于此，本文對PMSC的分子生物學(xué)特性做一綜述。

一、PMSC的來源

MSC來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，而胎盤的主體部分為羊膜及絨毛膜中胚層，提示胎盤為MSC很好的生物來源。Zhang等[1]討論了MSC在胎盤中的存在。人胎盤是一種由胎兒組織與母體組織共同組成的器官，羊膜和絨毛膜來源于胎兒，蛻膜則起源于母體，所以研究胎盤的細胞存在應(yīng)區(qū)分其不同來源。苗宗寧等[2]研究顯示臍帶附著處下方胎盤組織相對于其他部位更易獲取較多的MSC。In′t Anker等[3]首先報道了中期妊娠羊水是 MSC臨床應(yīng)用的含量豐富的來源。對比羊水來源以及羊膜來源的MSC發(fā)現(xiàn)，二者的生長特點及生長曲線相近。這些現(xiàn)象一方面說明胎盤中的確存在MSC，另一方面提示羊水中MSC極有可能來源于羊膜等實體組織。Miki等[4]研究證實羊膜上皮細胞具有干細胞特性并表達干細胞標(biāo)志基因。

另外，取材部位的不同將影響所獲取的MSC的數(shù)量及其增殖分化能力[5]。目前研究的PMSC，多是指胎兒面的PMSC，即羊膜和絨毛膜部位的細胞，但也有人報道了對母體來源的胎盤細胞即蛻膜部位的細胞的研究，認為其具有多能性、肌纖維母細胞性、來源廣、保存容易等特點[6-7]。

二、PMSC的分離方法

由于胎盤的結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣、細胞成分復(fù)雜，包括各種滋養(yǎng)細胞、間充質(zhì)細胞、Hofbauer細胞及各種血細胞等，因此在分離培養(yǎng)過程中受其他細胞干擾的情況嚴重。目前常用的PMSC分離方法主要有酶消化法、組織塊培養(yǎng)法和整體灌注法。

1.酶消化法：酶消化法應(yīng)用最為廣泛，常使用的酶消化法是先將組織剪碎，用酶消化后制成細胞懸液，再以密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細胞儀分選法或磁珠分選法進行分離。由于PMSC表面標(biāo)志不夠特異，應(yīng)用流式細胞儀分選法或磁珠分選法會造成大量細胞損失，且成本高。貼壁篩選法是利用PMSC貼壁生長的特性，通過貼壁培養(yǎng)及傳代，使細胞逐漸得到純化。密度梯度離心法則是利用細胞密度的差別，分離出密度在一定范圍內(nèi)的細胞[8]。由于胰蛋白酶是通過離解細胞間的黏蛋白和糖蛋白來破壞細胞骨架，從而使細胞分離，因此會對細胞活力產(chǎn)生一定的影響。而膠原酶主要離解細胞間質(zhì)的脯氨酸-中性氨基酸-甘氨酸-脯氨酸多肽，對間質(zhì)細胞影響較小[9]。PMSC消化所用的酶通常為膠原酶Ⅱ或Ⅳ，目前大多數(shù)實驗都采取膠原酶Ⅳ進行消化。陸琰等[8]研究顯示，使用膠原酶Ⅱ消化胎盤組織，結(jié)合羥乙基淀粉沉淀法能更好的分離PMSC。Bailo等[10]用胰蛋白酶、離散酶、DNA酶及膠原酶多次重復(fù)消化，促進細胞游離以達到獲得MSC的目的。

2.組織塊培養(yǎng)法：該方法將組織剪碎后不經(jīng)過酶處理，直接放在培養(yǎng)皿中使其貼壁生長。為提高細胞富集效率，F(xiàn)ukuchi等[11]采用外植胎盤組織塊法促進細胞貼壁；In′t Anker等[12]用 10 cm2羊膜或10 cm2蛻膜組織采用培養(yǎng)基中添加內(nèi)皮細胞生長因子及1﹪明膠包被培養(yǎng)板法，成功分離獲得MSC。李棟等[13]研究顯示，組織塊培養(yǎng)法雖然簡便易行，但其弱表達CD29和CD105，僅能向脂肪細胞分化。而酶消化法所得細胞符合MSC特征。但同時有其他研究表明[14]兩種方法得到的PMSC表面標(biāo)志表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。且組織塊培養(yǎng)法較酶消化法節(jié)省了消化組織等步驟，大大節(jié)省了操作時間，不僅避免了長時間酶消化對細胞的損傷，也避免了由于長時間操作而導(dǎo)致污染幾率增加的危險。目前兩種方法沒有定論，實驗多采用酶消化法，具體優(yōu)劣需隨著時間的推進加以印證。

3.整體灌注法：張毅等[15]用含肝素鈉的IMDM經(jīng)臍血管循環(huán)形成灌流途徑，去除胎盤內(nèi)殘留的臍血，然后在無菌條件下將胎盤置于培養(yǎng)基中室溫浸泡過夜，采用密度梯度離心法從組織浸出液中分離液獲得MSC，這種方法得到的MSC大小均勻，純度較高。李芳等[16]以D-Hank液灌注，在一定的壓力作用下，首先去除紅細胞干擾，其次破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，暴露內(nèi)皮下組織。收集培養(yǎng)的細胞即來自血管內(nèi)皮以及內(nèi)皮下組織。流式細胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)志以及多向誘導(dǎo)分化的實驗結(jié)果與酶消化分離培養(yǎng)的PMSC相同，并且生長速度更快，PMSC純度更高。由于灌注后獲取的細胞數(shù)量多，且成分相對單一，所以培養(yǎng)后PMSC純度高，其它細胞干擾較少。但需要胎盤組織完整不能有破損然而胎盤組織體積大，無菌操作要求更高，所以整體灌注的方法有待于進一步優(yōu)化。

三、PMSC的生物學(xué)特性鑒定

1.表面標(biāo)志及基因表達：目前各學(xué)者對PMSC表面標(biāo)志的鑒定多集中在整合蛋白家族CD29、透明質(zhì)酸受體CD44、間質(zhì)細胞標(biāo)志CD73、CD105以及 CD166，SH-2/CD105，SH-3，SH-4的高表達上[8，14，16，17，18]；此外，絨毛膜來源 MSC 還表達某些多潛能轉(zhuǎn)錄因子，如Sox-2、Nestin；CD106可有高表達、低表達或不表達，不表達造血細胞標(biāo)志CD34、CD45、CD14、HLA-DR和內(nèi)皮細胞表面標(biāo)志vWF、Flk-1、CD31以及特殊滋養(yǎng)層細胞的表面標(biāo)志等。Bailo等[10]對羊膜及絨毛膜細胞進行生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，羊膜及絨毛膜細胞共同表達的表面標(biāo)記為 CD105，CD44，CD90，CD54，CD73，CD29。令人感興趣的是，PMSC可以表達某些胚胎干細胞的表面標(biāo)記如SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，提示PMSC可能是非常原始的細胞群，具有更廣泛的自我更新和多系分化能力。另外有學(xué)者還進行了一系列細胞表面共刺激因子的檢測，發(fā)現(xiàn)包括 CD80、CD86、CD40/40L、B7/CD28、ICOS、4-1BB等在內(nèi)的共刺激分子在PMSC均不表達，表明PMSC免疫原性很低[19-20]。Fukuchi等[11]也用RT-PCR技術(shù)分析培養(yǎng)了2～18代的PMSC的不同基因，結(jié)果顯示其基因表達與骨髓來源的MSC很相似，可同時檢測出3個胚層的基因表達即器官特異性基因表達、造血內(nèi)皮基因表達、干細胞標(biāo)志基因表達。Parolini等[21]提出了鑒定PMSC的最基本標(biāo)準即貼壁生長，成纖維樣細胞形成菌落的能力，表達基本的特異性表面標(biāo)志，如CD90、CD73、CD105，不表達 CD45、CD34、CD14和HLA-DR，向一兩個譜系的細胞分化的能力，包括成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、胚胎起源的細胞等。

2.生長曲線及細胞周期：通過其生長曲線測定，傳代后潛伏期約為 24～48h，細胞倍增時間約為36～48h，細胞周期分析顯示，僅少數(shù) PMSC 處于分裂期，約95﹪的細胞處于G0/G1期。這一部分細胞保留自我更新和增殖能力，符合干細胞特性[22]。

3.多向誘導(dǎo)分化能力：因骨組織、脂肪、軟骨主要來源于中胚層，所以體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為骨、脂肪及軟骨的能力可能是細胞鑒定最基本和最關(guān)鍵的要求[5]。劉春麗等[23-25]通過實驗證實PMSC在特定誘導(dǎo)環(huán)境下不僅可以向成骨細胞及成脂肪細胞定向分化，而且在內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)可以向創(chuàng)傷修復(fù)細胞——內(nèi)皮細胞定向分化。有研究表明PMSC也可向外胚層細胞如神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和類神經(jīng)性細胞、心肌細胞及肝細胞分化[26-27]。

4.免疫抑制特性：由于胎盤來源的MSC一般不表達HLA-DR抗原，說明PMSC是免疫原性極低的細胞[28]。將羊膜及絨毛膜細胞移植入新生的豬和鼠體內(nèi)，通過兩種人重復(fù)DNA區(qū)域進行檢測發(fā)現(xiàn)這兩種動物體內(nèi)多個器官都可檢測到微小嵌合體[10]，說明PMSC不僅具有低免疫性，而且可以抑制其他細胞引起的免疫反應(yīng)，即具有免疫抑制性。圍繞免疫抑制的機制存在很多的爭論，如誘導(dǎo)CD8+T細胞凋亡學(xué)說、Fas受體學(xué)說和劑量依賴學(xué)說等[29-31]。以上這些機制都沒有定論，有可能是共同作用使PMSC具有免疫抑制性。

四、PMSC與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的比較

BMSC具有多向分化潛能，是組織工程、細胞移植和基因治療中研究的熱點。在細胞形態(tài)、貼壁生長、表達CD29、CD105、CD166和不表達CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR等方面，PMSC和BMSC生物學(xué)特性表現(xiàn)相同或相似[32]。BMSC體外培養(yǎng)方法簡單，增殖速度快，但成人BMSC含量低，隨著年齡增加其數(shù)量及增殖分化能力會隨之衰退，且多次取材對患者有損傷，這些都限制了BMSC在基礎(chǔ)及臨床上的應(yīng)用。相反，PMSC易分離培養(yǎng)，增殖迅速，可以向多種組織細胞分化。與捐獻骨髓或采集動員外周血相比，供者無痛苦，感染機會少。利用骨髓提取干細胞，受者的血型必須與骨髓捐贈者非常接近，才能不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，而PMSC則具有免疫調(diào)控的作用[10]。PMSC的增殖速度更快，而且更具長期生長的能力。另外，胎盤可以抑制細胞間相互刺激引起的T淋巴細胞增殖的現(xiàn)象，因此PMSC是臍帶血來源的造血干細胞體外培養(yǎng)的最佳滋養(yǎng)層細胞，對其有肯定的體外支持和擴增作用，而且PMSC的造血支持作用優(yōu)于BMSC[15]。通過對近幾年國內(nèi)外有關(guān)于PMSC研究的文獻回顧，我們總結(jié)PMSC較其它來源成體干細胞有如下優(yōu)點：（1）取材幾乎不受限制，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景；（2）PMSC具有發(fā)育上的原始性，較之其他組織類型來源的成體干細胞具有更好的自我更新和多向誘導(dǎo)分化能力；（3）不會給患者造成不必要的恐慌和繼發(fā)醫(yī)源性損害；（4）具有正常的染色體核型，致瘤實驗陰性，說明其遺傳性狀穩(wěn)定、安全。

五、臨床應(yīng)用及展望

人PMSC作為一種良好的“種子細胞”來源，它可以對受傷或病變的多種組織器官加以修復(fù)和重建。Ichim等[33]發(fā)現(xiàn)輸注入PMSC后可抑制心肌炎癥、抑制心肌細胞的凋亡、刺激血管增生，并可觀察到對擴張性心肌病有一定的療效，這些研究對心衰的細胞學(xué)治療有巨大的貢獻[34]。人羊膜上皮細胞體外定向分化的肝細胞可以表達至少30種人成體肝臟所表達的基因，這說明人羊膜上皮細胞來源的肝細胞對肝臟疾病可進行有效的治療[21]。將羊膜上皮細胞移植入脊髓損傷小鼠模型的受損部位后觀察到功能逐漸改善，用大鼠脊髓損傷評分系統(tǒng)評估小鼠后肢能力，最后達到19分，比正常動物的比分僅低2分[35]。Liu等[24]報道了PMSC具有促進創(chuàng)傷愈合的作用，并具有向創(chuàng)傷局部擴充歸巢，向創(chuàng)傷修復(fù)細胞——內(nèi)皮細胞定向分化的作用；還可作為VEGF的載體細胞，運載目的基因到達靶區(qū)域發(fā)揮VEGF的長效促愈功能。王博蔚等[36]通過研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因mdr1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可有效轉(zhuǎn)染PMSC，轉(zhuǎn)染的外源基因不但可充分表達，也可發(fā)揮正常的生理功能。

綜上所述，PMSC既有和其他來源MSC相似的生物學(xué)特征，同時在某些生物學(xué)特性方面有著其他來源MSC不具備的優(yōu)勢，是一種極具開發(fā)和研究價值的“種子細胞”。

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