囊胚注射大鼠多能干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大鼠胰腺

Kobayashi T 論著 路君 編譯

利用患者自身的多能干細(xì)胞、突破器官形成障礙、體外構(gòu)建完整的器官是再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的最終目標(biāo)。隨著誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以獲得患者的iPSC。雖然體細(xì)胞重編程還存在潛在分險(xiǎn)，但真正的挑戰(zhàn)是建立一種器官形成的方法。體外實(shí)現(xiàn)器官再造相當(dāng)復(fù)雜，囊胚互補(bǔ)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的方法之一。囊胚互補(bǔ)最早由Chen等報(bào)道，他們的研究證明Rag2-/-小鼠在囊胚期將野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cell，mESC）注射到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育出表型正常的小鼠。Rag2基因敲除引起小鼠胚胎發(fā)育過程中T、B淋巴細(xì)胞系缺失，小鼠體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞完全由野生型mESC發(fā)育而來。Nakauchi研究小組認(rèn)為，可以在基因敲除而造成器官發(fā)育缺失的模型動(dòng)物中復(fù)制這一現(xiàn)象，因此他們關(guān)注到胰腺及胰腺發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pdx1。胰腺和十二脂腸同型盒基因（pancreatic and duodenal homeobox1，Pdx1）在胰腺發(fā)育和β細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。Pdx1基因敲除小鼠出生后因胰腺缺失死亡。Nakauchi研究小組假設(shè)Pdx1-/-小鼠發(fā)育過程中因沒有胰腺器官而營(yíng)造了一個(gè)“發(fā)育微環(huán)境”，注射多潛能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）可形成完全由 PSC來源的、功能正常的胰腺。他們共設(shè)計(jì)了3組實(shí)驗(yàn)證明這種囊胚互補(bǔ)性。

研究的第一個(gè)目標(biāo)是在Pdx1基因敲除小鼠中獲得小鼠PSC（mPSC）來源的胰腺。用于注射囊胚的細(xì)胞有mESC和GT3.2小鼠iPSC。通過顯微注射將GT3.2miPSCs注入Pdx1-lacZ Knockin 小鼠（Pdx+/-）配對(duì)產(chǎn)生的子代囊胚中。結(jié)果顯示囊胚注射后出生的各基因型小鼠都有胰腺器官，其中也包括Pdx1-/-新生小鼠。Pdx+/-和Pdx+/+小鼠胰腺由自身細(xì)胞及外源EGFP-miPSC或mESC共同分化而來，與嵌合體動(dòng)物身體其他各器官一致。嵌合的Pdx-/-小鼠胰腺形狀和組織學(xué)檢測(cè)均正常，胰腺細(xì)胞（外分泌、內(nèi)分泌和導(dǎo)管上皮細(xì)胞）皆來源于EGFP-miPSC或mESC，但胰腺中的血管、神經(jīng)和成纖維細(xì)胞則由自體及外源細(xì)胞共同發(fā)育而來。Pdx1-/-嵌合小鼠可存活至成年，GTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Pdx1-/-嵌合小鼠胰島素分泌在高血糖時(shí)增加，血糖和正常小鼠類似。STZ誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生糖尿病，從表達(dá)EGFP的miPSC來源胰腺中分離的胰島移植在糖尿病小鼠腎包膜下。2個(gè)月后依然可以在移植處檢測(cè)到表達(dá)EGFP的miPSC來源的胰島細(xì)胞。移植后的糖尿病小鼠血糖能夠恢復(fù)正常，葡萄糖耐量（glucose tolerance testing，GTT）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常小鼠相似。這部分研究結(jié)果表明，發(fā)育過程中某個(gè)器官缺失能營(yíng)造出一個(gè)微環(huán)境（Pdx1-/-小鼠和胰腺缺失微環(huán)境）。PSC來源細(xì)胞可以代償?shù)恼紦?jù)這個(gè)微環(huán)境，形成一個(gè)幾乎由供方PSC發(fā)育而來的器官。

研究的第二個(gè)目標(biāo)是得到小鼠和大鼠的種間嵌合體。將EGFP標(biāo)記的GT3.2 miPSC注射到大鼠囊胚，或?qū)GFP標(biāo)記的大鼠iPSC（riPSC）注射到小鼠囊胚，注射的小鼠或大鼠iPSC能夠參與異基因動(dòng)物的胚胎發(fā)育并產(chǎn)生種間嵌合體動(dòng)物。嵌合的PSC分布在全身各器官，且具有正常功能。種間嵌合動(dòng)物中異基因來源細(xì)胞比例明顯低于種內(nèi)嵌合，大鼠或小鼠嵌合體的檢測(cè)結(jié)果均一致。大鼠母親生育的嵌合體動(dòng)物形態(tài)與新生大鼠相似，而由小鼠母親生育的則形態(tài)類似于正常的新生小鼠。異源細(xì)胞的貢獻(xiàn)率會(huì)影響嵌合動(dòng)物體型。組織免疫染色的結(jié)果可見EGFP陽性細(xì)胞存在于多種組織和器官中，但異種細(xì)胞未參與種間嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞分化。大鼠沒有膽囊，而小鼠有膽囊。當(dāng)mPSC注入大鼠囊胚產(chǎn)生的種間嵌合體（與大鼠體型相似）沒有膽囊，相對(duì)的rPSC注入小鼠囊胚產(chǎn)生的嵌合體（體型與小鼠相似）有膽囊。

研究的第三個(gè)目標(biāo)是，通過囊胚注射在Pdx1-/-小鼠體內(nèi)產(chǎn)生異基因的大鼠胰腺。riPSC作為供方細(xì)胞，囊胚注射后139個(gè)胚胎種植在假孕小鼠子宮，34個(gè)小鼠出生。Pdx1-/-種間嵌合體胰腺幾乎都是EGFP陽性細(xì)胞。經(jīng)免疫組織熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)EGFP的riPSC來源的胰腺細(xì)胞可共表達(dá)α-淀粉酶（外分泌標(biāo)志基因）、胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)素（內(nèi)分泌標(biāo)志基因）。嵌合riPSC的Pdx1-/-小鼠能生長(zhǎng)至成年（8周），胰腺中絕大部分細(xì)胞為EGFP陽性細(xì)胞。成年小鼠的GTT實(shí)驗(yàn)中，可見葡萄糖升高引起胰島素分泌增加。這部分結(jié)果表明注射riPSC到Pdx1-/-小鼠胚胎成功的創(chuàng)造出擁有大鼠胰腺的嵌合小鼠，該技術(shù)被稱為“種間囊胚互補(bǔ)”。

有研究報(bào)道過類似的技術(shù)，如胸腺上皮發(fā)育、心臟缺損修復(fù)、卵巢造血細(xì)胞及生殖細(xì)胞的克隆研究，但是沒有研究曾證明外源細(xì)胞可形成完整的器官，彌補(bǔ)發(fā)育中的致死性缺陷，使嵌合體動(dòng)物存活至成年。目前，體外將PSC分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法主要是采用多步誘導(dǎo)的方式。然而體外誘導(dǎo)的方法還有待于改進(jìn)，胰島素分泌量及葡萄糖響應(yīng)方面仍需提高，且未分化的iPSC還有引起畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過囊胚互補(bǔ)的方法在體內(nèi)形成胰腺，模擬了近于正常的發(fā)育過程和表觀遺傳改變，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染誘導(dǎo)的iPSC成瘤風(fēng)險(xiǎn)還需長(zhǎng)期觀察。

本研究成功的在Pdx1-/-小鼠中獲得功能正常的大鼠胰腺。所有注射riPSC的Pdx1-/-小鼠囊胚出生后都有胰腺組織，盡管只有部分嵌合體動(dòng)物能活到成年，成年動(dòng)物riPSC來源的胰腺形態(tài)和組織學(xué)正常，未出現(xiàn)糖尿病癥狀，GTT結(jié)果表明胰腺功能良好。已往研究表現(xiàn)在異基因環(huán)境中可以形成有功能的細(xì)胞（精子、肝細(xì)胞），不過此前沒有在異基因環(huán)境中PSC形成器官并能夠拯救致死性突變至成年的報(bào)道。這種器官再造模式有望用于在豬或其他大型動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生人的器官，但是要將此技術(shù)用于臨床還有許多的難題需要克服。本研究獲得了小鼠和大鼠的嵌合體動(dòng)物，但這一過程中的胚胎致死率高、成年動(dòng)物存活率低。豬或綿羊與人的胚胎發(fā)育存有很大差異，可能難以實(shí)現(xiàn)囊胚互補(bǔ)。另外一個(gè)問題就是PSC來源的細(xì)胞不僅存在于胰腺，還存在于包括腦和生殖腺的所有器官，尚沒有適合控制PSC分化的方法，因此這種在牲畜體內(nèi)獲得人類器官的方式面臨嚴(yán)峻的倫理質(zhì)疑。

綜上所述，該研究向人們描繪了一種實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)終極目標(biāo)的可能途徑。