缺血再灌注損傷與細胞信號轉導

凌今，凌人，黃彬彬，葉煒劍，叢維濤，金利泰

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缺血再灌注損傷與細胞信號轉導

凌今，凌人，黃彬彬，葉煒劍，叢維濤，金利泰

325035 溫州醫(yī)學院藥學院蛋白質組學中心（凌今、黃彬彬、葉煒劍、叢維濤、金利泰）；321000 浙江金華廣福醫(yī)院病理科（凌人）；321000 浙江金華市人民醫(yī)院藥劑科（凌今）

短暫的缺血會對器官造成損傷，但是在恢復灌注后，損傷反而進一步加劇，這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。臨床上涉及缺氧/復氧過程的手術都不可避免地會發(fā)生 IRI，比如重大器官的移植、冠脈搭橋、溶栓術等。IRI 一直是醫(yī)學研究的熱點，近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）時，鈣超載、供能不足和氧自由基的大量產生等理化因素刺激細胞，誘發(fā)信號介導的細胞損傷、凋亡是造成 IRI 的一個重要原因。本文就 IRI 與信號通路的研究進展做簡要綜述。

1 缺血再灌注損傷

缺血時器官以無氧酵解方式呼吸供能，胞內累積大量乳酸，pH 下降。再灌注時，細胞為了恢復正常的 pH 水平，泵入 Na+以交換 H+，但 Na+過量引發(fā)了 Ca2+內流，迅速升高的 Ca2+造成細胞鈣超載，最終導致死亡[1]。過量生產的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在 IRI 的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的推動作用，即使在臨床手術時應用抗氧劑，其損傷往往也難以有效遏制。缺血發(fā)生時，細胞降低代謝水平來適應供能供氧不足的情況，再灌注時，細胞代謝水平迅速恢復正常，但氧化供能短時間無法滿足其需求，這也是造成細胞損傷的又一原因[2-3]。功能細胞是器官的關鍵組成，代謝非?；钴S，因而易受到最致命的影響。功能細胞的大量死亡宏觀表現(xiàn)為器官的功能障礙，暫時或永久性的功能障礙即缺血再灌注損傷。

2 細胞信號轉導

生物體是由一群具有特殊結構與功能的細胞并由細胞膜組成的復雜有機體，其內的大分子、細胞器、細胞、組織和器官在空間上是相互隔離的，且大多數(shù)細胞不與外界環(huán)境直接接觸，因此多細胞生物對外界的刺激（包括物理、化學、生物因素）需要細胞間復雜的信號轉導系統(tǒng)通過級聯(lián)系統(tǒng)傳遞，從而調控機體內功能各異細胞的新陳代謝和行為，以保證整體生命活動的正常進行?？梢哉f，所有重要的生命現(xiàn)象都與細胞內信號轉導有關。細胞信號轉導通常是指細胞通過細胞表面受體接受外界信號，通過系統(tǒng)級聯(lián)傳遞機制，將細胞外信號轉導為胞內信號，最終引起細胞生理反應或誘導特定基因的表達，引起細胞的應答反應[4]。病理狀態(tài)下，細胞的信號轉導發(fā)生改變，其中一部分級聯(lián)信號激活自身防御及代償機制，提高機體對疾病的抗性；另一部分信號則誘發(fā)細胞代謝紊亂，介導細胞凋亡，促進疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，探究疾病狀態(tài)下信號轉導變化，可以為臨床治療開辟一條嶄新的道路。

3 缺血再灌注的病理生理學特點

在病理條件下，冠脈閉塞 15 ~ 20 s，糖酵解隨即成為高能磷酸化供能的唯一方式。雖然短時間內可以維持心肌細胞的基礎能量需求，但是當缺血時間延長至 60 ~ 90 min 時，提供 ATP 的無氧酵解過程基本停滯，細胞幾無能量供應，梗死面積逐步擴大，心臟攣縮。

再灌注時，心臟的能量需求恢復，然而功能的恢復卻相對滯后，緩慢地達到缺血前的狀態(tài)，這個現(xiàn)象被稱為心肌鈍抑。鈍抑的心肌往往消耗大，做功少，效率低下。這主要是因為在再灌注時脂肪酸氧化、糖酵解和丙酮酸氧化速率大幅升高。高速率的脂肪酸 β 氧化極大地抑制了葡萄糖氧化，致使葡萄糖氧化和糖酵解水平失衡。血漿內的高濃度游離脂肪酸可進一步抑制丙酮酸的氧化。如果糖酵解與葡萄糖氧化偶聯(lián)，那么糖酵解不產生 H+。然而如果糖酵解不與葡萄糖氧化偶聯(lián)，丙酮酸則酵解生成乳酸，這個過程中由于 ATP 的水解，每個葡萄糖分子凈生成 2 個 H+。這種葡萄糖氧化和酵解的解耦合作用是心臟內 H+的主要來源。代償供能產生的 H+蓄積于細胞內，再灌注時細胞會把 Na+泵入胞內，置換出 H+，從而恢復 pH 值到正常水平。Na+的大量流入刺激了細胞內的 Na+與細胞外的進行 Ca2+交換，Na+/Ca2+的交換效率很高，細胞內 Ca2+很快出現(xiàn)超載現(xiàn)象，最終導致了細胞的死亡[5]。

基于上述細胞代謝的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體膜上非選擇性的通道——線粒體通透性轉換孔（mPTP）是再灌注損傷的決定性因素。再灌注期間，線粒體通透性決定了細胞存亡：如果通透性較小，細胞可能恢復；通透性中等，細胞發(fā)生凋亡；通透性極大，細胞則因為能量供應不足而壞死。在心肌缺血期間 mPTP 是關閉的，僅在再灌注的前幾分鐘開啟，以適應線粒體鈣超載、氧化應激、pH 的恢復以及 ATP 耗竭。這個通道的開放破壞了線粒體膜電位，阻斷了氧化磷酸化，導致了 ATP 的耗竭，細胞最終死亡[6]。

此外，細胞內諸如 H+、Ca2+量的改變破壞了線粒體膜電位，導致了活性氧自由基的產生?；钚匝鯐苯訐p傷 DNA、蛋白質、脂類，這種非特異性的損傷經過細胞因子介導，生成腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α。過表達的 TNF-α 與心肌細胞上的腫瘤壞死因子受體結合，引起心臟收縮功能障礙、心肌肥大、纖維化和細胞死亡。胞內過量的 Ca2+與焦磷酸形成復合物，同時產生尿酸，磷酸鈣和尿酸被稱為“危險信號”，都是強炎癥刺激物。炎癥刺激物包括現(xiàn)有炎性分子的增多以及白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）的分泌等。這些炎性物質刺激Toll 樣受體（TLRs）進而通過激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）促進炎性細胞因子和趨化因子產生。在再灌注的最初6 h，梗死區(qū)域內中性粒細胞趨化因子釋放，并在未來 24 h 遷移到心肌組織。此過程促進中性粒細胞黏附，引起血管堵塞，并釋放降解酶和更多的 ROS。正如上文所述，這些代謝變化又直接影響組織的炎癥和完整性，甚至細胞的存活。

4 缺血再灌注損傷與信號通路

4.1 Toll 樣受體 4 信號通路

Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR-4）是 1997 年 Rock 等[7]首次發(fā)現(xiàn)的一種類果蠅源的 Toll 樣受體，在人體內分布較為廣泛。TLR-4 介導的信號通路包括髓樣細胞分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性途徑和 MyD88 非依賴性途徑。MyD88 依賴性途徑是通過其與 TLR-4 相互作用，經 TIR 區(qū)域向細胞內傳遞信號，最終活化 NF-κB 進入細胞核，誘導一系列特定基因的表達，引起多種炎性細胞因子的釋放，造成細胞損傷。

Wang 等[8]采用 BALB/c 小鼠和 TLR-4 先天性缺損小鼠（C3H/HeJ）研究肝臟 IRI。實驗發(fā)現(xiàn)，C3H/HeJ 組小鼠肝功能損傷程度、血清 TNF-α 水平顯著低于對照組，提示 TLR-4 受體激活，可增加 TNF-α 參與肝臟 IRI 損傷。Zhai 等[9]進一步研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4 敲除對小鼠肝臟 IRI 有保護作用，而 TLR-2 敲除無此作用。Oyama 等[10]在小鼠心肌 IR 模型中發(fā)現(xiàn)，TLR-4 缺陷型小鼠（C57/BL10ScCr）心肌中多形核白細胞（polymorphonuclear，PMN）浸潤顯著減少，炎癥反應減輕，心肌梗死面積較小。Chong 等[11]采用 C3H/HeJ（TLR-4 基因缺失）小鼠復制了心肌 IRI 實驗，驗證了 TLR-4 介導心肌 IRI 損傷的結論。Wu 等[12]在研究腎臟 IRI 時發(fā)現(xiàn)，缺血后腎小管上皮細胞存在 TLR-4 表達和 PMN 浸潤，而 TLR-4 缺陷型小鼠在 IR 后腎功能和腎實質損傷明顯減輕。同時，在 MyD88 缺陷型小鼠身上觀察到和 TLR-4 缺陷型小鼠一樣的保護作用，說明 TLR-4 通過 MyD88 依賴性信號通路介導 IRI。后來，Hua 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4 缺失型小鼠保護心肌 IRI 的作用可被磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶（phoshatidy linositol-3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K/Akt）抑制劑消除，提示 TLR-4 和 PI3K/Akt 通路存在交叉，TLR-4-/-小鼠抗心肌 IRI 是通過 PI3K/Akt 信號轉導通路實現(xiàn)的。

4.2 缺氧誘導因子信號通路

細胞感知氧水平改變，供氧不足時改變細胞生理狀態(tài)，通過缺氧誘導因子（hypoxia-inducible transcription factor，HIF）氧敏感性轉錄通路，結合缺氧調控元件（HRE），調控多種基因表達，提高細胞對缺氧的適應性。同時，HIF 在IRI 中也表現(xiàn)為一種有益因子。Natarajan 等[14]通過 siRNA 干擾小鼠微血管內皮細胞 PHDs 表達來增加 HIF 的表達，發(fā)現(xiàn) iNOS 表達也隨之增加，IR 后，梗死面積顯著減少。然而，iNOS 基因敲除的小鼠無抗 IRI 的作用。Xi 等[15]在體外模型中應用氯化鈷激動 HIF，發(fā)現(xiàn)能減少梗死面積，而在 iNOS 敲除的小鼠器官中則沒有觀察到保護作用。這些研究表明，在 IRI 中，HIF 可以上調 iNOS 消除 IR 產生的 ROS 發(fā)揮保護作用。

Pachori 等[16]用 RNA 技術誘導大鼠血紅素加氧酶 1（heme oxygenase，HO-1）過表達，觀察到 HO-1 過表達的大鼠心臟、肝臟等器官在發(fā)生 IR 時損傷減輕，這是由于 HO-1 及其催化產生的血膽紅素、CO 均具有抗氧化應激損傷的作用。HO-1 催化氧化需消耗大量氧分子，競爭了氧自由基的氧來源，減少氧自由基的產生。膽紅素能清除活性氧，在多種疾病中發(fā)揮抗氧化作用，而 CO 在一定范圍內可減少 ROS 的生成。再灌注時 HIF 上調，誘導 HO-1 表達增加，通過上述途徑發(fā)揮抗氧化作用，減輕器官的再灌注損傷，這可能是 HIF 抗 IRI 的又一途徑。

4.3 促分裂素原活化蛋白激酶途徑

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）途徑是介導細胞反應的重要信號系統(tǒng)，參與了細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種生理反應的過程。MAPK 是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，由多種同工酶組成，主要包括細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun 氨基酸末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和 p38MAPK。

4.3.1 ERK 信號通路 ERK 被認為是經典的 MAPK 信號通路途徑。研究發(fā)現(xiàn)，ERK 在正常細胞中低表達，而受到 IR 的刺激后，pERK 顯著上調。對于 IR 刺激下 ERK 通路的激活，是發(fā)揮保護作用還是介導凋亡，學術界尚無定論。

部分學者認為 ERK 通路激活在 IRI 中發(fā)揮保護作用。Tao 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1- phosphate，SIP）通過激活 ERK 促進成年小鼠心肌細胞在 IR 模型中的存活。Yue 等[18]和 Das 等[19]報道激活 ERK 通路可減少 IR 誘發(fā)的細胞凋亡，宏觀上縮小心肌梗死的面積。ERK 通路可能通過如下幾個方面發(fā)揮保護作用：①ERK 促進 B 細胞淋巴瘤基因 2（B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2）表達，拮抗凋亡蛋白 Bax 表達，減少 caspases-3 活化；②Bcl-2 與 c-myc 共同阻止 p53 入核及其誘導細胞凋亡作用；③ERK 激活核糖體 S6 蛋白激酶（RSK）可使環(huán)腺苷酸應答元件結合蛋白（cAMP）磷酸化，協(xié)同抑制細胞凋亡，促進細胞存活；④ERK 激活可提高 ATP 水平，恢復供能；⑤可拮抗 JNK，p38 信號通路的促凋亡作用。

另外一部分學者則持相反觀點。Stanciu 等[20]、Tsoporis等[21]和 Tong等[22]在各自的研究中發(fā)現(xiàn)，激活 ERK 通路會導致培養(yǎng)的細胞的 IRI 加重。更多的研究分析 ERK 可能通過以下途徑介導損傷：①ERK 是 p53 的上游信號分子，pERK 可激活 p53 磷酸化，介導細胞凋亡；②ERK 激活后通過 ERK1/2/Elk/Egr-1 通路上調 Egr-1 蛋白，介導 IR 損傷；③ERK 激活 miR-1 和 miR-206 抑制 Hsp60 表達，削弱 Hsp60 保護作用，加重器官 IRI；④ERK 激活可導致活性氧（ROS）產生增加，引起 IRI。

ERKs 作為 MAPKs 中經典通路，參與了細胞生理、病理過程。不同的實驗發(fā)現(xiàn) ERK 在 IR 中扮演了截然相反的角色，這可能與 IRI 進程有關。IRI 早期，ERK 的激活可啟動內源性的保護機制，而在 IRI 中晚期則以介導細胞損傷為主。

4.3.2 JNK 通路 JNK 位于細胞質中，當 IR 刺激激活 JNK 發(fā)生磷酸化時，pJNK 轉入細胞核中參與細胞增殖、代謝、凋亡等調控。Ferrandi 等[23]在大鼠心肌 IR 模型中應用 AS601245（JNK 選擇性抑制劑）可以減少細胞凋亡和梗死面積。Okuno 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血區(qū)的 pJNK 水平增高，應用 JNK 抑制劑 SP600125 可以阻止 Bax 從胞質轉入胞核，抑制神經元的凋亡。Carboni 等[25]應用抑制劑 AS601245 處理小鼠神經細胞可有效減輕 IRI。大量實驗發(fā)現(xiàn)，IR 發(fā)生時，JNK 活性顯著升高。其抑制劑可降低 IR 引起的細胞凋亡，提示 JNK 參與了 IRI 的進程。

JNK 在 IRI 中介導細胞凋亡主要有兩個機制：①轉錄因子途徑：JNK 激活后調控下游因子轉錄，上調凋亡蛋白表達，介導凋亡途徑引起細胞凋亡，如：JNK 活化后進入細胞核，啟動轉錄因子和 ATF-2、AP-1、Elk-1 等，誘發(fā) FasL、TNF-2、BH3-only 蛋白表達上調，激活凋亡程序；②非轉錄因子途徑：部分活化的 JNK 不進入細胞核，不參與轉錄、調控，而是在細胞質中直接作用于 Bcl-2，引起線粒體通透性的改變，誘發(fā)細胞凋亡。

4.3.3 p38 MAPK 信號通路 p38 MAPK 是 MAPKs 中的又一重要通路?；罨?p38 在細胞成活、分化、發(fā)育、炎癥以及應激反應等生理、病理進程中發(fā)揮重要作用。IR 發(fā)生時，釋放的氧自由基和細胞因子激活 p38 MAPK，將胞外刺激傳遞到胞內，引起蛋白表達改變，誘發(fā)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)[26-27]，在再灌注前使用 p38 MAPK 特異性阻滯劑 SB203580、FR167653 等可以有效抑制 p38 MAPK 的激活，減少再灌注器官的損傷。p38 MAPK 通過以下幾個途徑介導細胞凋亡：①上調 c-myc 表達，c-myc 是細胞凋亡的主要誘因；②促進 p53 磷酸化；③參與 Fas 介導的凋亡；④激活 c-Jun 和 c-fos；⑤誘導 Bax 轉位；⑥激活 NF-κB，提高 TNF-α 等炎性因子表達，誘發(fā)細胞炎性損傷。細胞的炎性損傷和凋亡最終導致再灌注器官的功能障礙和衰竭。

4.4 磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路

Akt 是PI3K/Akt通路的核心，也是 PI3K 下游的直接作用靶點。許多細胞因子、生長因子、理化刺激均可以活化PI3K，從而磷酸化 Akt，激活下游級聯(lián)反應和靶蛋白之間的相互作用。

大量研究表明，在 IR 發(fā)生時，激活 PI3K/Akt 信號通路可以顯著抑制心肌細胞凋亡，縮小梗死面積。Li 等[28]發(fā)現(xiàn)，胰島素與受體結合，可激活其受體的酪氨酸激酶，進一步激活 PI3K/Akt 通路，上調下游靶蛋白 p70S6K 和 eNOS，產生保護心肌的作用。Raphael 等[29]應用異氟烷預處理兔體，發(fā)現(xiàn)其心臟在 IRI 中梗死面積和凋亡細胞減少，Western blot 顯示 pAkt、pBad 和 Bcl-2 上調，而 Bax 下調，PI3K 抑制劑可拮抗該保護作用，提示 PI3K/Akt 活化后可減少 Bad 介導的細胞凋亡，參與了異氟烷對 IRI 的保護作用。馬亞飛等[30]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素預處理亦可對抗心肌 IRI，這種保護作用可以被 Akt 選擇性抑制劑 LY294002 阻斷，推測葛根素的保護作用可能也與 PI3K/Akt 信號通路的激活有關。王巖[31]采用分別給予 PI3K、Akt、eNOS 抑制劑的方法干預普伐他汀對心肌 IRI 的保護作用，結果顯示 PI3K、Akt、eNOS 均可特異性拮抗普伐他汀對兔心肌 IRI 的保護作用，顯示普伐他汀通過 PI3K/Akt/eNOS 信號通路發(fā)揮作用。

實驗觀察到不同種類藥物發(fā)揮 IRI 保護作用時均激活了 PI3K/Akt 信號通路，而特異性抑制劑拮抗其保護作用，說明 PI3K/Akt 通路的激活對心臟起保護作用。更多研究表明，活化 Akt 能作用于下游 eNOS、Bcl-2、GSK-3β、caspase-9、p70S6K 等多個靶點，并最終減少 mPTP 的開放，穩(wěn)定線粒體膜，減少促凋亡因子活化，發(fā)揮抗凋亡、保護再灌注器官的作用。

5 總結與展望

綜上所述，HIF 作為特異性氧敏感性轉導通路在缺血及再灌注 2 個損傷環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要調節(jié)作用。MAPKs 在 IR 時激活，ROS 與 MAPK 通路存在交互作用，ROS 能誘導 MAPK 的激活，同時這些激酶亦可反作用調節(jié) ROS 水平。p38 被證實可以調節(jié)線粒體內 ROS 水平，通過 Raf/MEK/ERK 通路對抗線粒體內過多的 ROS 和 Ca2+，減少細胞凋亡。然而 ERK 是否起到細胞保護作用仍然未有定論。另一方面，先天免疫和炎癥在 IRI 中已有深入研究，促炎因子和免疫調節(jié)因子在 IR 時表達增加。Toll 樣受體是這些免疫和炎癥誘導物的結合受體，它在炎癥誘導的 IRI 中起核心作用。細胞損傷時釋放的高遷移率蛋白（HMGB1）是一種 TLRs 配體。ROS 可通過上調 HMGB1，增加其與 TLRs 結合來激活 NF-κB，經 NF-κB 信號介導在 IRI 時調節(jié)炎癥因子的產生[32]。在諸如腦、肺、肝、腎、腸等器官中也觀察到了相似的作用[33]。此外，PI3K/Akt 的激活可以對抗缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡。心肌缺失 TLR-4 小鼠的 NF-κB 結合激活減少以及 Akt 磷酸化水平增加，不易發(fā)生 IRI，而使用小分子抑制 PI3K 可以完全消除 TLR-4 缺失小鼠的 IRI 心肌保護作用，提示 TLR-4 和 PI3K/Akt 通路存在交叉[34-35]。

目前，在臨床上防治 IRI 并無特效藥物，隨著 IRI 與細胞信號轉導研究的不斷深入，對 IRI 發(fā)病機制的了解也越發(fā)透徹，這為防治 IRI 新藥的研發(fā)提供了更多嶄新的思路。

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浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（2011R413043）；國家自然科學基金（30971406）

金利泰，Email：jin_litai@yahoo.cn

2012-11-30

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.009