K－Ras與B－Raf在前列腺癌組織表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

王朝暉，李玉中，宋麗媛

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.實(shí)驗(yàn)中心；2.檢驗(yàn)科；3.病理科，遼寧 大連116027）

隨著人口老齡化程度的加劇及人們生活條件的改善，前列腺癌的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，躍居男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。近年來(lái)分子靶向藥物酪氨酸激酶受體抑制劑TKI（tyrosine kinase inhibitor）在臨床上已廣泛應(yīng)用。該藥的作用機(jī)制通過(guò)抑制EGFR（epidermal growth factor receptor）酪氨酸磷酸化，阻止 EGFR－Ras－Raf－MEK－ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。研究K－Ras和BRaf在前列腺癌組織的表達(dá)，旨在探討其與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院2010年1－12月手術(shù)切除的前列腺癌病理組織蠟塊74例，74例癌癥患者中年齡34－92歲，平均年齡（58.00±13.51）歲。標(biāo)本按2002年 WHO腫瘤國(guó)際組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)：其中高中分化癌23例，低分化癌51例；按Whitmore－Jewett（ABCD）系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：其中（A＋B）期40例，為未浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移組；（C＋D）期34例，為浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移組。前列腺增生39例，患者年齡40－87歲，平均年齡（62.34±14.37）歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療和生物治療。

1.2 方法

用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素過(guò)氧化物酶（SP）法檢測(cè)K－Ras和B－Raf蛋白在前列腺癌和增生組織中的表達(dá)。K－Ras和B－Raf單克隆抗體分別購(gòu)自Ab－cam和Santa Cruz，使用濃度分別為1∶200和1∶400。SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。操作步驟按免疫組化試劑盒要求進(jìn)行，組織切片在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中用微波抗原熱修復(fù)100℃10分鐘，用磷酸鹽緩沖液代替一抗做空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

K－Ras和B－Raf在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞（－）；陽(yáng)性細(xì)胞＜25%（＋）；25%≥陽(yáng)性細(xì)胞＜50%（＋＋）；陽(yáng)性細(xì)胞≥50%（＋＋＋）。（＋）以上為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組或多組計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 K－Ras在前列腺癌組織的表達(dá)

K－Ras在前列腺癌組織的表達(dá)（79.73%，49／74）明顯高于前列腺增生（23.08%，9／39），χ2＝19.025，P＜0.01。在高中分化和低分化的表達(dá)分別為 （65.22%，15／23）和 （66.67%，34／51），χ2＝0.15，P＞0.05；在未浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移（A＋B）期和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移（C＋D）期 表 達(dá) 分 別 為 （60.00%，24／40）和（73.53%，25／34），χ2＝1.504，P＞0.05。

2.2 B－Raf在前列腺癌組織的表達(dá)

B－Raf在前列腺癌組織的表達(dá)（64.86%，48／74）明顯高于前列腺增生（10.26%，4／39），χ2＝30.659，P＜0.01。在高中分化與低分化表達(dá)分別為（43.48%，10／23）與 （74.51%，38／51），χ2＝6.698，P＜0.05，在（A＋B）期與（C＋D）期表達(dá)分別為 （42.50%，17／40）與 （91.18%，31／34），χ2＝19.107，P＜0.05。

2.3 K－Ras和B－Raf蛋白表達(dá)的相關(guān)性

K－Ras和 B－Raf蛋 白 表 達(dá) 呈 正 相 關(guān)，r2＝0.272，P＝0.019，P＜0.05。

3 討論

Ras／Raf／MAPK （mitogen－activated protein kinase）信號(hào)通路是細(xì)胞生物學(xué)中最具特征的通路，是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞的重要途徑，該通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和重要基因的表達(dá)［1］。Ras是一種鳥(niǎo)核苷酸結(jié)合蛋白，具有內(nèi)源性GTP酶活性，它包括K－Ras、N－Ras、H－Ras等，Ras編碼小GTP結(jié)合蛋白，參與很多細(xì)胞功能如細(xì)胞分化及蛋白運(yùn)輸?shù)取as／Raf／MAPK信號(hào)通路中的膜受體被一些生長(zhǎng)因子激活后，進(jìn)而激活Ras蛋白，活化的Ras－GTP直接與下游Raf的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并使其激活，活化的Raf又激活下游的MAPK，從而激活了MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Raf作為Ras下游的關(guān)鍵性蛋白之一，是絲氨酸／蘇氨酸激酶家族成員，亞型包括Raf、A－Raf和B－Raf。MAPK激活后可以激活多種核轉(zhuǎn)錄因子和激酶，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，且當(dāng)活力失控時(shí)會(huì)導(dǎo)致腫瘤［2，3］。

K－Ras在前列腺癌中的表達(dá)國(guó)內(nèi)研究較少，本研究顯示前列腺癌組織的表達(dá)明顯高于前列腺增生，但其與腫瘤的分化程度和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移差異無(wú)顯著性意義，說(shuō)明K－Ras基因過(guò)表達(dá)在前列腺癌的發(fā)生中起一定促進(jìn)作用。

B－Raf基因突變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)生發(fā)展中有其獨(dú)特而重要的作用［5，6］。目前國(guó)內(nèi)在結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤及甲狀腺癌中研究較多，但在前列腺癌組織研究較少。Yuen［7］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中分化程度越低B－Raf蛋白表達(dá)越高，Houben［8］研究發(fā)現(xiàn)BRaf的突變狀態(tài)與惡性黑色素瘤的分期及預(yù)后呈正相關(guān)。本研究顯示，B－Raf蛋白在前列腺癌組織表達(dá)明顯高于前列腺增生，這說(shuō)明B－Raf蛋白過(guò)表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，B－Raf蛋白的過(guò)表達(dá)與前列腺癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)，即分化程度越低B－Raf表達(dá)越高，與浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)，即預(yù)后越差B－Raf蛋白表達(dá)越高。與Yuen和Houben研究的其他腫瘤的表達(dá)規(guī)律基本一致，BRaf蛋白的過(guò)表達(dá)預(yù)示著前列腺癌的預(yù)后較差。

如果Ras／Raf／MAPK信號(hào)通路中的某一成員發(fā)生突變，就會(huì)引起通路下游效應(yīng)蛋白的功能發(fā)生改變，通路保持持續(xù)激活狀態(tài)，必然會(huì)引起細(xì)胞異常增殖以及凋亡障礙等［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，K－Ras與BRaf在前列腺癌的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明二者在前列腺癌的發(fā)生中起協(xié)同作用。他們中的一個(gè)因子或多個(gè)因子過(guò)度表達(dá)，都會(huì)激活Ras／Raf／MAPK信號(hào)通路，從而參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

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［2］Liemann C.Regulation of MAP kinase activity by peptide receptor signalling pathway：paradigms of multiplicity［J］.Cell Signal，2002，13：777.

［3］Avruch J，Khokhlatchev A，Kyriakis JM，et al.Ras cactivition of the Raf kinase：tyrosine recruitment of the MAP kinase cascade［J］.Recent Prog Horn Res，2001，56：127.

［4］Norman KL，Hirasawa K，Yang AD，et al.Reovirus oncolysis：the Ras／RalGEF／p38pathway dictates host cell permissiveness to reovirus infection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：11099.

［5］Mitsutake N，Knauf JA，Mitsutake S，et al.Conditinal－BRAFV600Eexpression induces DNA synthesis，apoptosis，dedifferentiation，and chromosomal instability in thyroid PCCL3cells［J］.Cancer Res，2005，65（6）：2465.

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［8］Houben R，Becker JC，Kappel A，et al.Constitutive activation of the Ras－Raf signaling pathway in metastatic melanoma is associated with poor prognosis［J］.Carcinog，2004，3（1）：6.