Gadd45在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

王 赟，季洪亮

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001）

Gadd45與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)，全稱為生長(zhǎng)阻滯與DNA損傷誘生蛋白45（growth arrest and dNA damage inducible protein 45，Gadd45），其基因家族屬于p53和BRCA1的下游靶基因，在細(xì)胞生存及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Gadd45家族由Gadd45α、Gadd45β和Gadd45γ三個(gè)成員組成，它們的基因排列序列非常相似，通常會(huì)在環(huán)境損傷因子作用下，隨DNA修復(fù)過(guò)程的啟動(dòng)而誘導(dǎo)產(chǎn)生。電離輻射及紫外線照射等多種損傷因素可快速誘導(dǎo)產(chǎn)生Gadd45α，Gadd45α受p53與BRCA1的調(diào)節(jié)，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)及維持基因組穩(wěn)定等過(guò)程來(lái)抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的進(jìn)展。Gadd45β主要通過(guò)對(duì)p53和JNK的調(diào)控從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Gadd45γ可在電離輻射、紫外線照射等基因損傷因子誘導(dǎo)下呈上調(diào)表達(dá)，受p53蛋白的調(diào)控，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有負(fù)向調(diào)控作用，抑制細(xì)胞增殖的同時(shí)可促進(jìn)其凋亡。Gadd45基因不僅與細(xì)胞生存與凋亡密切相關(guān)，而且還參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤形成過(guò)程，其在細(xì)胞的不同狀態(tài)下發(fā)揮不同甚至相反的作用。

1 Gadd45在細(xì)胞損傷反應(yīng)中的作用

Gadd45家族的同源蛋白在細(xì)胞損傷反應(yīng)中起重要作用。Gadd45基因編碼一組18kDa進(jìn)化性保守的蛋白 ，且相互間高度同源性。這些蛋白是強(qiáng)酸性的，同時(shí)存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。Gadd45α，最初命名為Gadd45，克隆自紫外線照射的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中，是重要的生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷修復(fù)（gadd）基因。Gadd45β，最初命名為 MyD118，自M1原始粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞經(jīng)分化誘導(dǎo)物治療后的蛋白中分離而來(lái)，是骨髓分化初級(jí)應(yīng)答基因（MyD）之一。Gadd45γ是應(yīng)用 MyD118（Gadd45β）cDNA探針克隆而來(lái)，是白介素2（IL2）促進(jìn)的T細(xì)胞中早期快速反應(yīng)基因。

在鼠的多個(gè)組織，每一個(gè)Gadd45基因的表達(dá)水 平 均 不 相 同。 此 外，Gadd45α、Gadd45β 和Gadd45γ的表達(dá)受多種環(huán)境和生理?yè)p傷的誘導(dǎo)，這些損傷包括甲基甲磺酸（MMS）、電離 輻射（IR）、紫外線輻射（UV）、VP－16、柔紅霉素和炎癥因子［1］等。所有病例中，患者表達(dá)Gadd45基因均是唯一的，這與每一個(gè)Gadd45家族成員對(duì)特定的損傷產(chǎn)生反應(yīng)相一致。由于這些特定的表達(dá)形式，每一個(gè)Gadd45基因的表達(dá)調(diào)控都是唯一的。例如，Gadd45α是p53的靶基因，因此它的誘導(dǎo)是p53依賴性的；Gadd45β是IL－6和 TGF－b的初級(jí)反應(yīng)基因，而Gadd45γ則是IL－2和IL－6的初級(jí)反應(yīng)基因［2］。

Gadd45蛋白參加由環(huán)境和生理?yè)p傷引起的細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡，同時(shí)在發(fā)育和致癌過(guò)程中也起重要作用。在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)中，Gadd45可以與配體蛋白相互作用，同時(shí)可以調(diào)節(jié)配體蛋白的結(jié)構(gòu)/功能。這個(gè)生物學(xué)作用高度依賴與損傷的形式，強(qiáng)度和細(xì)胞的種類［3］。可以和Gadd45相互作用的蛋白有PCNA、組蛋白、cdk1、p21、MEKK4、MKK7以及p38。Gadd45蛋白與PCNA和/或組蛋白的相互作用可能在修復(fù)調(diào)節(jié)DNA去甲基化激活的基因中起重要作用［4，5］。與cdc2/細(xì)胞周期蛋白B1復(fù)合物的相互作用可以抑制該復(fù)合物的激酶活化從而導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M停滯。當(dāng)Gadd45α與p21相互作用時(shí)，可以增加它的CDKI活性，從而導(dǎo)致G1期停滯。Gadd45與MEKK4和p38聯(lián)合可導(dǎo)致它們的活化。MEKK4的N端可以與它的C端末端裂片結(jié)合，從而抑制C端激酶區(qū)域，而Gadd45與MEKK4的N端Gadd45結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后可以破壞這個(gè)N－C結(jié)合，引起激酶的活化［6］。Gadd45蛋白還通過(guò)與上游激酶調(diào)節(jié)子相互作用來(lái)活化或抑制JNK 活性［7，8］。Gadd45β是內(nèi)源性NF－κB抑制凋亡的主要影響因素，這種調(diào)節(jié)存在于多個(gè)細(xì)胞系。在成纖維細(xì)胞中，這個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制包括通過(guò)與ATP激酶直接結(jié)合來(lái)激活MKK7和JNK。 研 究 發(fā) 現(xiàn) 存 在 一 個(gè) MKK7－Gadd45β：Gadd45MKK7四聚體復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物的復(fù)合性可以通過(guò)MKK7分離而增加。Gadd45蛋白包含多個(gè)蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。Gadd45蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)如何改變其功能還不清楚，Gadd45蛋白和不同的家族成員可以組成單或異聚體；而他們調(diào)節(jié)Gadd45功能的作用機(jī)制還不清楚。

有推測(cè)說(shuō)Gadd45和它的配體蛋白的相互作用受Gadd45及其配體蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞定位和翻譯后修飾所調(diào)節(jié)，還有可能由刺激的類型，大小及細(xì)胞種類所決定。

2 Gadd45作為應(yīng)激反應(yīng)基因調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)

應(yīng)激反應(yīng)基因在監(jiān)視致癌刺激和調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)中的復(fù)雜作用還不完全清楚。在腫瘤形成中，研究最多的致癌應(yīng)激反應(yīng)因子是p53及其多個(gè)細(xì)胞功能。最近研究表明，無(wú)論體內(nèi)還是體外，Gadd45蛋白均是重要的致癌應(yīng)激反應(yīng)因子。小鼠細(xì)胞需要導(dǎo)入兩種活化的癌基因才能產(chǎn)生癌變，破壞Gadd45基因后單個(gè)癌基因即可引起癌變。對(duì)Gadd45α缺陷小鼠中獲得的MEFs而言，H－ras完全能夠引起癌變。Gadd45β和Gadd45γ在易感性 MEFs中引起單癌基因變形的功能還在研究中。

研究發(fā)現(xiàn)Gadd45蛋白在體內(nèi)腫瘤發(fā)育的調(diào)節(jié)中也起作用。對(duì)Gadd45α缺陷和Gadd45β缺陷小鼠觀察發(fā)現(xiàn)存在基因突變頻繁、電離輻射易感性和化學(xué)致癌作用易感性。這也證明腫瘤細(xì)胞的存活依賴于NF－κB調(diào)節(jié)的Gadd45α和Gadd45β抑制.

在不同腫瘤中的Gadd45家族成員頻繁突變還有待研究。通過(guò)啟動(dòng)子甲基化來(lái)抑制Gadd45家族三個(gè)成員的表達(dá)已在多種人類腫瘤中觀察到。在大多數(shù)乳腺癌中，Gadd45α啟動(dòng)子被甲基化，導(dǎo)致和正常乳腺上皮細(xì)胞相比Gadd45α表達(dá)減少［9］。在腦下垂體瘤中，67%的患者可以觀察到Gadd45γ基因表達(dá)沉默。這種下調(diào)和Gadd45γ基因甲基化相一致，而拮抗這種甲基化改變可以引起該蛋白的過(guò)表達(dá)。Gadd45γ還在甲狀腺癌和65%肝癌中表達(dá)下調(diào)，均是由于Gadd45γ啟動(dòng)子的高甲基化。其他研究還發(fā)現(xiàn)，在肝癌中Gadd45家族三個(gè)基因都有甲基化和沉默，這說(shuō)明Gadd45基因表達(dá)和肝癌生成間存在必然聯(lián)系［10］。此外，丙型肝炎病毒引起的Gadd45β表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。丙型肝炎病毒中的Gadd45β啟動(dòng)子高甲基化和這種細(xì)胞周期變化有關(guān)，且和丙型肝炎病毒相關(guān)肝癌有聯(lián)系［11］。Ying等在75個(gè)細(xì)胞系中分析Gadd45γ啟動(dòng)子兩個(gè)區(qū)域的甲基化狀態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞系中啟動(dòng)子高甲基化出現(xiàn)頻繁，包括85%非霍奇金淋巴瘤、50%霍奇金淋巴瘤、73%鼻咽癌、50%頸部腫瘤、29%食道癌和40%肺癌，但在正常上皮細(xì)胞系、正常組織或外周血單核細(xì)胞中卻沒有這種甲基化。為了獲得Gadd45γ甲基化的更多信息，他們還進(jìn)行了高分辨率亞硫酸氫鹽測(cè)序。最后發(fā)現(xiàn)在所有表達(dá)沉默的細(xì)胞系中均有高密度甲基化CpG位點(diǎn)，這表明Gadd45γ沉默可能和腫瘤的發(fā)病有關(guān)。在前列腺癌中也可以觀察到Gadd45α的甲基化調(diào)節(jié)。由于其在多西紫杉醇治療中表達(dá)上調(diào)，且可能和多西紫杉醇調(diào)節(jié)的前列腺癌細(xì)胞毒性有關(guān)，Gadd45α被認(rèn)為是前列腺癌的潛在的治療靶點(diǎn)［12］。其他研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中激活 NF－κB可導(dǎo)致 Gadd45α和Gadd45γ抑制。因此，活化NF－κB和啟動(dòng)子甲基化可能聯(lián)合作用抑制腫瘤中的Gadd45基因。

在胰腺癌中也發(fā)現(xiàn)異常Gadd45α表達(dá)。有研究表明Gadd45α在多個(gè)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中表達(dá)升高，而抑制Gadd45α表達(dá)可抑制其中一個(gè)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)和存活［13］。另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在PANC1胰腺癌細(xì)胞系中，Gadd45α異位表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡［14］。這兩個(gè)研究中，在胰腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和存活中Gadd45α的作用相矛盾。研究發(fā)現(xiàn)，54%人類胰腺導(dǎo)管癌中Gadd45α表達(dá)水平提高。而且，和Gadd45α表達(dá)水平未見異常的病人相比，Gadd45α蛋白的過(guò)表達(dá)和p53功能缺失協(xié)同，可引起預(yù)后不良。在可切除的侵襲性胰腺導(dǎo)管癌中，Gadd45α頻繁突變，這種突變和p53的狀態(tài)一樣，都影響著病人的預(yù)后。通過(guò)shRNA抑制內(nèi)源性Gadd45α表達(dá)可以限制細(xì)胞數(shù)，這是由于細(xì)胞周期停滯和/或凋亡。因此，需要進(jìn)一步研究以明確Gadd45α及其他家族成員在胰腺癌發(fā)生中的作用。

最近研究重點(diǎn)是Gadd45α作為致癌刺激反應(yīng)因子在乳腺癌發(fā)生中的作用［15］。通過(guò)比較分析MMTV－Myc和 MMTV－Ras小鼠，發(fā)現(xiàn) Gadd45α在乳腺癌發(fā)生中即是抑制因子，又可以是促進(jìn)因子，這主要取決于針對(duì)不同致癌刺激的信號(hào)通路。Gadd45α腫瘤抑制功能主要通過(guò)活化JNK和p38刺激激酶來(lái)調(diào)節(jié)，這可以促進(jìn)Ras誘導(dǎo)的凋亡和衰老，且只對(duì)Ras致癌刺激反應(yīng)。相反，Gadd45α的腫瘤促進(jìn)功能通過(guò)GSK3b/b連環(huán)蛋白級(jí)聯(lián)的MMP10表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)，可以導(dǎo)致腫瘤血管化增加，且只對(duì)癌基因Myc反應(yīng)。這一新發(fā)現(xiàn)表明Gadd45α通過(guò)不同的信號(hào)通路，即可促進(jìn)，又能抑制乳腺癌的生成，這主要取決于活化癌基因的分子結(jié)構(gòu)。

3 Gadd45在白血病中的作用

在白血病細(xì)胞中，Gadd45的表達(dá)可以被不同的刺激誘導(dǎo)，這包括分化誘導(dǎo)因子和遺傳毒性因子。在骨髓分化起始時(shí)即可誘導(dǎo)Gadd45基因，這表明Gadd45蛋白在白血病中起重要作用。在Gadd45α或Gadd45β缺陷小鼠的外周血或骨髓中未發(fā)現(xiàn)明顯異常，然而在血液的刺激下，細(xì)胞因子的急性刺激、骨髓消融、炎癥和遺傳毒性刺激，Gadd45α和Gadd45β缺陷小鼠均表現(xiàn)出異常反應(yīng)［16］。

Gadd45蛋白作為致癌刺激反應(yīng)因子，在造血細(xì)胞發(fā)育中它的表達(dá)調(diào)節(jié)和對(duì)刺激的反應(yīng)表明在白血病中它的表達(dá)改變起重要作用。Fms酪氨酸激酶（FLT3）的激活突變存在于AML的基因損傷中，表現(xiàn)在大約30－35%AML病例中［17］。最常見的突變是細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)部銜接重復(fù)（ITD）。在一組AML樣本中通過(guò)檢測(cè)Gadd45αmRNA水平來(lái)研究其與FLT3－ITD 突 變 的 關(guān) 系［18］，在 FLT3－ITD＋ AML中 Gadd45αmRNA 水 平 明 顯 低 于 FLT3－ITDAML，這和AML中FLT3－ITD誘導(dǎo)的Gadd45α下調(diào)有關(guān)。此外，在原始AML樣本中Gadd45α表達(dá)的研究顯示與正常組相比Gadd45α明顯低表達(dá)。

提高M(jìn)yc表達(dá)在許多白血病和實(shí)體腫瘤中均有表現(xiàn)。多個(gè)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)能夠調(diào)節(jié)Myc致癌基因。Myc的異常調(diào)節(jié)并不局限于Myc基因的異常，還可出現(xiàn)與調(diào)節(jié)分子控制myc基因表達(dá)引起的直接或間接突變。這說(shuō)明Myc的異常調(diào)節(jié)和髓樣白血病中其他致癌基因，如AML1－ETO、PM－RARA以及PLZF－RAR的活化，F(xiàn)LT3受體酪氨酸激酶活化突變，以及BCR－ABL相關(guān)。在小鼠模型中，急性髓性白血病可以快速誘導(dǎo)myc，而不需要淋巴瘤相關(guān)抗細(xì)胞凋亡突變，而且Mcl1單劑量不足可以抑制小鼠myc誘導(dǎo)的急性髓性白血?。?9，20］。研究發(fā)現(xiàn)，在 myc過(guò)表達(dá)的骨髓細(xì)胞中，Gadd45α的缺失可以減少凋亡，從而增加細(xì)胞增殖。這表明Gadd45α在調(diào)節(jié)白血病中發(fā)揮腫瘤抑制物的作用。

4 小結(jié)與展望

在很多實(shí)體腫瘤以及血液系統(tǒng)腫瘤中均觀察到Gadd45的表達(dá)異常。大量研究結(jié)果表明Gadd45蛋白即可促進(jìn)又可抑制腫瘤的生成，這不僅與致癌基因的分子結(jié)構(gòu)及細(xì)胞類型密切相關(guān)，而且還與參與作用的不同信號(hào)通路有關(guān)。進(jìn)一步的研究旨在明確Gadd45蛋白如何與不同信號(hào)通路相作用，從而對(duì)不同的致癌刺激所產(chǎn)生促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。由此可見，Gadd45蛋白及其信號(hào)靶點(diǎn)可能會(huì)成為一個(gè)新的癌癥基因治療的分子靶點(diǎn)。

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