結(jié)直腸癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的臨床意義

黃彥欽 沈虹 李墨丹 袁瑛

微衛(wèi)不穩(wěn)定(microsatellite instbility，MSI)又稱復(fù)制錯(cuò)誤(replication error，RER)，其意義是腫瘤細(xì)胞與同一個(gè)體的正常組織細(xì)胞DNA相比，腫瘤細(xì)胞的基因組DNA中單個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或四個(gè)核苷酸組成的重復(fù)序列長度發(fā)生了改變［1-2］。最初的研究認(rèn)為，MSI是遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)特征性的分子變化，與人類錯(cuò)配修復(fù)基因(mismatch repair，MMR)的種系突變有關(guān)。而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)一小部分的散發(fā)性大腸癌也存在著MSI現(xiàn)象，但這種MSI大都與hMLH1基因的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)有關(guān)。

目前有兩種方法明確腫瘤的MSI狀態(tài)。一種是RER試驗(yàn)，即設(shè)計(jì)引物通過PCR的方法擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，常用的檢測位點(diǎn)是美國國家癌癥研究所(NCI)專家推薦的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)(BAT26、BAT25、D2S123、D5S346 和 D17S250)。通過正常組織和腫瘤組織的比較，如果2個(gè)以上位點(diǎn)存在MSI狀態(tài)則認(rèn)為該患者是高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-high，MSI-H)，即錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷(defective MMR，dMMR);如果小于2個(gè)位點(diǎn)存在MSI狀態(tài)或無一位點(diǎn)存在MSI狀態(tài)，則認(rèn)為該患者是低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-low，MSI-L)或微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)，即錯(cuò)配修復(fù)功能完整(proficient MMR，pMMR)。除NCI專家推薦的這五個(gè)位點(diǎn)，也可擴(kuò)增Sargent等［3］推薦的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，如大于30%的位點(diǎn)陽性則患者為MSI-H，如小于30%的位點(diǎn)陽性則患者為MSI-L，所有位點(diǎn)都陰性則患者為MSS。此方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，很難在基層醫(yī)院開展。另一種MSI的檢測方法是采用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical staining，IHC)檢測腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2蛋白的表達(dá)，如這四個(gè)蛋白均陽性表達(dá)，說明該患者為pMMR狀態(tài);如這四個(gè)蛋白中任一蛋白為陰性表達(dá)，則患者為dMMR狀態(tài)。此方法相對(duì)簡單易行，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較低，成本也較低，容易在基層醫(yī)院的病理科開展實(shí)施。

美國癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)的結(jié)直腸癌指南中明確指出小于50歲的患者和所有的II期結(jié)直腸癌患者在術(shù)后選擇輔助化療前，均需明確腫瘤的MSI狀態(tài)。筆者就從這兩個(gè)方面對(duì)MSI因素在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義做一闡述。

一、檢測MSI狀態(tài)明確小于50歲結(jié)直腸癌患者的遺傳背景

已有研究表明約三分之一結(jié)直腸癌的發(fā)生與遺傳相關(guān)，這其中又以HNPCC最為常見，約占所有結(jié)直腸癌的1% ～5%。MSI現(xiàn)象是HNPCC的一個(gè)重要特征。錯(cuò)配修復(fù)基因遺傳性缺陷是HNPCC的病因，而MSI現(xiàn)象正是這些錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷在基因組上的表現(xiàn)。但是，并不是所有MSI結(jié)直腸癌都是HNPCC。有MSI表現(xiàn)的結(jié)直腸癌約占所有結(jié)直腸癌的15%，而HNPCC只占到其中的3% ～5%，其余的10%～12%是由結(jié)直腸癌體細(xì)胞hMLH1基因甲基化導(dǎo)致的［4］。同樣，并不是有明顯家族聚集現(xiàn)象的結(jié)直腸癌都會(huì)有MSI表現(xiàn)。臨床上與HNPCC完全相符的家族聚集性結(jié)直腸癌無MSI表現(xiàn)者可達(dá)20%以上，這種家族聚集結(jié)直腸癌被稱作癌家族X綜合癥［5］。因此，可以說MSI表現(xiàn)與HNPCC是同一原因引起的兩種不同表象。

從理論上講，MSI因素可能包含著HNPCC的發(fā)病機(jī)制。MMR基因缺陷導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，DNA在復(fù)制過程中錯(cuò)配概率增加，突變積累，最后引發(fā)癌癥。這是一個(gè)看上去比較合理的假設(shè)。但是，我們?cè)贖NPCC腫瘤組織上發(fā)現(xiàn)的MSI狀態(tài)絕大部分并不在基因的外顯子區(qū)域，而往往在內(nèi)含子區(qū)或基因之間的區(qū)域。1997年NCI專家制定了判定MSI狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)，即將 BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，D17S150 等 5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)作為不穩(wěn)定程度的標(biāo)準(zhǔn)［6］，有2個(gè)及2個(gè)以上位點(diǎn)不穩(wěn)定者為MSI-H，但這些位點(diǎn)并不在基因的重要區(qū)域。目前已知的HNPCC相關(guān)MSI位點(diǎn)中，體細(xì)胞TGFBRII基因上的MSI位點(diǎn)可能與結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［7］，遺傳性TGFBRI基因6A微衛(wèi)星序列可能與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)，但這方面的研究尚未有進(jìn)一步突破。

MSI和HNPCC均由MMR基因缺陷引起，但不同的MMR基因或不同的MMR基因突變方式引起的結(jié)直腸癌似乎并不相同。MMR基因在人類基因組中多達(dá)12個(gè)，但目前已知與HNPCC的發(fā)生有關(guān)的僅有4個(gè)(hMLH1，hMSH2，hMSH6和hPMS2)。最近，有專家認(rèn)為一個(gè)與hMSH2相關(guān)的EPCAM基因突變可能也是HNPCC的致病因素［8］。這些基因遺傳性突變的頻率和產(chǎn)生腫瘤的類型均有不同，hMSH2和hMLH1占到所有突變的90%以上，其產(chǎn)生的腫瘤大多為結(jié)直腸癌，hMSH6突變約占6%，其突變者中子宮內(nèi)膜癌患病率明顯高于其他基因突變者［9］。同樣是hMLH1基因變異的結(jié)直腸癌，hMLH1啟動(dòng)子甲基化引起者與hMLH1遺傳性突變者的結(jié)直腸癌生物學(xué)特性也存在差異，前者對(duì)5-氟尿嘧啶的化療不敏感，而后者則相對(duì)較敏感［10］。在這些MMR基因突變的結(jié)直腸癌中，MSI表現(xiàn)則較為一致，BAT25、BAT26等單核苷酸重復(fù)序列的不穩(wěn)定仍然是最常見的MSI現(xiàn)象。

由于幾乎所有已證實(shí)存在MMR基因突變的HNPCC組織中均存在MSI現(xiàn)象，因此對(duì)所有臨床確診的結(jié)直腸癌患者檢測MSI狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)MSI-H者在排除hMLH1甲基化的原因后同時(shí)檢測患者外周血中MMR基因的遺傳性突變，可篩選出HNPCC患者，但單獨(dú)采用檢測MSI狀態(tài)方法篩選HNPCC患者可能不是一種經(jīng)濟(jì)的方法［11］。結(jié)直腸癌組織MMR蛋白的IHC檢測也有相同的作用［12］，將MSI檢測與IHC檢測聯(lián)合應(yīng)用則有較好的成本效果比［11］。在利用檢測MSI狀態(tài)方法篩選HNPCC的過程中，當(dāng)篩查發(fā)現(xiàn)MSI-H者，還需將遺傳突變引起的MSI狀態(tài)與體細(xì)胞hMLH1基因突變引起的MSI狀態(tài)做鑒別，此時(shí)用BRAF基因上V600E突變位點(diǎn)做排除篩選是一個(gè)非常有效的方法，因?yàn)榉彩怯蠦RAF基因突變者均不是HNPCC。應(yīng)用上述方法對(duì)所有結(jié)直腸癌患者進(jìn)行篩查，可發(fā)現(xiàn)其中3．6%的患者為 HNPCC［13］。由于 MSI-H結(jié)直腸癌的發(fā)病年齡較早，椐 Mecklin等［14］的報(bào)導(dǎo)，在HNPCC家系表中中，80%的大腸腫瘤發(fā)生在50歲以前，12%發(fā)生在39歲以下，而1%發(fā)生在70歲以上，因此，推薦對(duì)發(fā)病年齡小于50歲的患者常規(guī)進(jìn)行MSI的檢測，以明確其遺傳背景。

二、檢測MSI狀態(tài)指導(dǎo)II期結(jié)直腸癌患者術(shù)后的輔助治療

對(duì)于散發(fā)性結(jié)直腸癌而言，MSI狀態(tài)首先是一個(gè)預(yù)后相關(guān)標(biāo)記。大量回顧性研究的結(jié)果提示，無論是在II期患者還是III期結(jié)直腸癌患者中，MSI-H的錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷(dMMR)的結(jié)直腸癌患者往往能夠獲得更好的預(yù)后［15-19］。2005年發(fā)表在JCO上的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)［20］。Sargent等［3］對(duì)507 例患者進(jìn)行了 MSI狀態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)II期結(jié)直腸癌組織分化程度差患者中dMMR比例明顯高于其他類型。單因素分析的結(jié)果顯示，在只接受手術(shù)治療而未行術(shù)后輔助化療的患者中，dMMR(MSI-H)組的無復(fù)發(fā)生存(disease-free survival，DFS)明顯優(yōu)于pMMR組，這些結(jié)果提示MSI狀態(tài)對(duì)患者而言是一項(xiàng)有意義的預(yù)后因素。雖然這一結(jié)論尚未被多因素分析所證實(shí)，但在單因素分析中較高的HR值仍提示其對(duì)患者的預(yù)后起到了較強(qiáng)的保護(hù)作用。研究提示這種保護(hù)作用可能與MSI-H狀態(tài)下腫瘤VEGF表達(dá)水平及微血管密度有關(guān)［21-22］。

MSI狀態(tài)除了能夠作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存的預(yù)后因子外，研究還顯示MSI狀態(tài)對(duì)5-氟尿嘧啶在結(jié)直腸癌患者中的療效預(yù)測上也存在著一定的意義。20世紀(jì)90年代起，以5氟尿嘧啶(5-FU)和亞葉酸鈣為主的化療方案成為了III期大腸癌患者以及部分II期高危大腸癌患者的術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)輔助化療方案［23-26］。目前，國際上關(guān)于III期大腸癌患者常規(guī)接受含5-氟尿嘧啶類藥物的方案化療已經(jīng)達(dá)成共識(shí)。然而，是否應(yīng)該對(duì)II期大腸癌進(jìn)行術(shù)后常規(guī)輔助化療仍然存在爭議。部分臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在接受輔助化療的II期大腸癌患者中只有約3%的患者生存期得到了提高［27-28］，而從已有的研究結(jié)果來看，這些患者似乎并未從含5-氟尿嘧啶的化療方案中獲益。也正因?yàn)槿绱耍?004年美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)提出:不推薦在II期結(jié)腸癌患者中進(jìn)行常規(guī)術(shù)后輔助化療。

由于II期大腸癌具有與其他期結(jié)直腸癌所不同的臨床特征和分子表現(xiàn)(MMR缺失和MSI高發(fā)生率)，人們開始關(guān)注5-氟尿嘧啶療效是否與II期大腸癌與眾不同的分子特征存在關(guān)聯(lián)性。Ribic等［29］首先提出了dMMR的腫瘤無法從5-氟尿嘧啶化療中獲益的假說。目前許多關(guān)于MMR與化療療效的研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，hMLH1缺失的細(xì)胞系會(huì)對(duì)5-氟尿嘧啶產(chǎn)生抗藥性，這一抗藥性通常是由hMLH1啟動(dòng)子甲基化所引起的。實(shí)驗(yàn)同時(shí)也提示hMLH1缺失狀態(tài)可以被去甲基物質(zhì)5氮胞苷所逆轉(zhuǎn)。而另一項(xiàng)異種移植實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了伴MSI現(xiàn)象的大腸癌存在對(duì)5-氟尿嘧啶的抗藥性［29］。Sargent等對(duì)457例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行MSI狀態(tài)檢測及隨訪后發(fā)現(xiàn)，無論術(shù)后病理分期是II期還是III期，接受5-氟尿嘧啶化療并不能改善dMMR患者的DFS和OS，尤其對(duì)于dMMR的II期大腸癌患者而言，5-氟尿嘧啶輔助化療反而會(huì)降低OS。

由于dMMR結(jié)直腸癌患者相對(duì)pMMR患者預(yù)后相對(duì)更佳，因此dMMR患者不接受術(shù)后輔助化療也是一種可選擇的治療策略。美國胃腸協(xié)作組正在進(jìn)行的E5202試驗(yàn)，將II期結(jié)直腸癌患者按照手術(shù)前MSI狀態(tài)以及染色體18q的雜合性缺失情況分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行輔助化療或觀察隨訪，這個(gè)研究結(jié)果將進(jìn)一步明確MSI及18qLOH對(duì)II期腸癌預(yù)后的影響［30］。而由于dMMR或MSI-H狀態(tài)的II期結(jié)直腸癌并不能夠從5-FU的術(shù)后化療中獲益，因此不推薦對(duì)這些患者進(jìn)行5-FU的術(shù)后化療，這樣也可以避免治療相關(guān)的毒性、花費(fèi)以及化療所引起的生活質(zhì)量的下降。值得注意的是，雖然在Sargent等人的研究中提示pMMR狀態(tài)的II期結(jié)直腸癌患者在接受了5-氟尿嘧啶化療后在DFS和OS上均有獲益，但現(xiàn)有的證據(jù)并不支持將pMMR作為II期患者術(shù)后輔助化療的高危因素。目前公認(rèn)的臨床高危因素仍是腫瘤分期為T4、穿孔、腸梗阻、腫瘤分化程度差、存在血管浸潤及清掃淋巴結(jié)數(shù)目小于12枚［31］。

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