芯片技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)遺傳染色體異常診療中的應(yīng)用指南

ACMG

聲明：此實(shí)踐指導(dǎo)旨在為醫(yī)療工作者在進(jìn)行專(zhuān)業(yè)醫(yī)學(xué)遺傳咨詢(xún)時(shí)提供參考。此實(shí)踐指導(dǎo)不能完全保證最佳醫(yī)療效果。此指導(dǎo)并未涵蓋所有的診療手段與檢查，也無(wú)意摒除某些特定的診療手段與檢查。遺傳咨詢(xún)專(zhuān)家應(yīng)基于患者個(gè)體差異以及樣本差異決定適當(dāng)?shù)臋z查與診療手段。如對(duì)患者使用與本指導(dǎo)不一致的診療，決策原因必須加以記錄。

1 簡(jiǎn) 介

隨著比較基因組雜交芯片以及單核苷酸多樣性微陣列分析等微陣列技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)室對(duì)于患者在發(fā)育遲緩／智力障礙（DD／ID）、先天畸形以及異形的評(píng)價(jià)體系在近幾年產(chǎn)生了很大的變化?；颊呋蚪M中無(wú)法用經(jīng)典G 顯帶方法檢測(cè)的小缺失和小重復(fù)，現(xiàn)在都能用這些方法檢測(cè)到。由于這些年全基因組拷貝數(shù)微陣列技術(shù)在臨床應(yīng)用的日漸廣泛，我們?cè)谶@里對(duì)相關(guān)指南進(jìn)行更新。

2 微陣列技術(shù)在基因組拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用

自從20世紀(jì)60年代晚期染色體顯帶技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，細(xì)胞遺傳學(xué)診斷檢查已經(jīng)發(fā)生了顯著的變化［2］。一些DNA 相關(guān)技術(shù)，例如基因組拷貝數(shù)微陣列（細(xì)胞遺傳學(xué)微陣列，即CMA），已經(jīng)成為目前臨床應(yīng)用的最新技術(shù)［1］。比較基因組雜交最初是用來(lái)通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全基因組不平衡重組的篩查［1，3-5］。然而傳統(tǒng)意義上的比較基因組雜交只有3～10 Mb［4］的分辨率，與高分辨率核型分析區(qū)別不大［1］，所以后來(lái)被微陣列技術(shù)加以利用［6］。芯片比較基因組雜交技術(shù)是利用玻璃襯底來(lái)附著被克隆的細(xì)菌人工染色體（BACs）或被合成的如寡聚核酸（oligos）DNA 片段，從而作為基因組在染色體上的精確定位［1，7，8］。通過(guò)比較患者和標(biāo)準(zhǔn)DNA 的雜交效率可得出拷貝數(shù)差異［7］，單核苷酸多態(tài)性雜交芯片可用來(lái)檢測(cè)基因組拷貝數(shù)差異，也可以檢測(cè)拷貝數(shù)中立區(qū)的同源性。這種情況下，患者的DNA 被標(biāo)記并雜交到微陣列上，通過(guò)比較患者及某一已知DNA 的雜交結(jié)果來(lái)得出結(jié)論［9］。需要指出的是，并不是所有的基因組拷貝數(shù)變異都是病理現(xiàn)象，目前已知正常人平均基因組拷貝數(shù)變異在800 或更多［10］。

芯片的分辨率及產(chǎn)出取決于其對(duì)基因組的覆蓋率（探針的 長(zhǎng) 度 和 間距）［3，11，12］，以及統(tǒng)計(jì)時(shí)設(shè) 定 的標(biāo)準(zhǔn)。微陣列技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析具有更高的分辨率，為鑒別染色體異常提供了更加精確、敏感的技術(shù)。

3 臨床應(yīng)用

Rauch等［13］通過(guò)研究不明原因認(rèn)知障礙患者的遺傳診斷，比較了不同遺傳學(xué)檢查的有效性。他們的研究表明，分子核型分析對(duì)新型染色體異常僅有不到0.6%的漏檢率。他們指出分子核型分析在認(rèn)知障礙患者單測(cè)試診斷中確診率最高（28.9%），故作者提議此檢查作為一線檢測(cè)。近日Miller等［14］發(fā)表的一篇綜述討論將CMA 作為發(fā)育遲緩／智力障礙（DD／ID）、多種并發(fā)先天畸形、自閉癥候群（ASD）的一線檢測(cè)手段。上述基于21 698例具有相關(guān)癥狀患者的研究表明，CMA 作為一線檢測(cè)具有比傳統(tǒng)G 顯帶染色體核型分析檢測(cè)手段高12.2%的確診 率。Hochstenbach 等［15］通 過(guò) 評(píng) 估36 325例DD／ID 患者得出結(jié)論，CMA 適合作為此類(lèi)患者的一線檢測(cè)。他們發(fā)現(xiàn)病理性異常達(dá)到19%。Shen等［16］研究了CMA 在自閉癥患兒診斷中的應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)CMA 適用于此類(lèi)病患的一線檢測(cè)方案。他們發(fā)現(xiàn)核型分析以及脆性X 染色體檢測(cè)的檢出率分別為2.23%和0.46%，而微陣列的檢出率為18.2%（n＝848），其中7%為顯著異常。用CMA 檢測(cè)到的新型拷貝數(shù)變異（CNVs）以及亞顯微缺失和復(fù)制，表現(xiàn)出與ASD 的相關(guān)性，這些異常往往位于基因組中與自閉癥相關(guān)的基因位點(diǎn)［19，20］。CMA 還被應(yīng)用到某些用傳統(tǒng)方法檢測(cè)為平衡易位但具有生理性或認(rèn)知障礙的患者。CMA 檢測(cè)顯示這些易位往往是不平衡易位，數(shù)個(gè)研究顯示大約有20%的個(gè)體，用傳統(tǒng)方法檢測(cè)顯示為新發(fā)或家族性平衡易位，但用CMA 檢測(cè)時(shí)顯示為非平衡易位［21，22］。近期研究表明CMA 在其他醫(yī)學(xué)應(yīng)用中也有顯著價(jià)值。Adam 等報(bào)道了3例發(fā)育遲緩或異形患者，通過(guò)CMA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了抑癌基因的微缺失。在另一個(gè)病例數(shù)更大的研究中，Adams等［24］發(fā)現(xiàn)大約0.18%的患者具有腫瘤易感基因的缺失或獲得。2篇報(bào)道的作者都強(qiáng)調(diào)了CMA 在這些檢測(cè)中的重要性，提示CMA 除了能為發(fā)育遲緩／并發(fā)先天性畸形提供遺傳學(xué)解釋?zhuān)材転檫@些患者提供腫瘤易感性信息。

微陣列分析不僅能檢測(cè)某些影響特定基因拷貝數(shù)的變異，也能辨別由于基因組斷裂被破壞的基因。這種破壞可能是由于破壞編碼序列，也可能是由于影響到轉(zhuǎn)錄或翻譯效率。相關(guān)的例子如斷裂破壞了轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，也有例子表明NRXN1 和CNTN4基因會(huì)被這種情況破壞［25，26］。Moeschler等［27，28］以及Saam 等［1，29］指出，正確的診斷能為臨床醫(yī) 生提供機(jī)會(huì)明確治療方法、預(yù)后、復(fù)發(fā)幾率以及避免不必要的檢測(cè)。

4 檢測(cè)平臺(tái)

盡管微陣列分析能有效檢測(cè)染色體不平衡，最終能提高患者治療水平［29］，臨床醫(yī)生在下醫(yī)囑前應(yīng)了解不同的臨床檢測(cè)平臺(tái)特性（例如選擇BAC 還是oligo，選擇針對(duì)某組基因還是全基因組或單核苷酸多態(tài)性），以及不同平臺(tái)能提供的不同分辨率和信息量。例如，許多臨床醫(yī)生不了解全基因組寡聚核苷酸芯片技術(shù)能檢測(cè)到細(xì)菌人工染色體芯片技術(shù)不能檢測(cè)到的拷貝數(shù)變異［30］，也不了解單核苷酸多態(tài)性芯片能檢測(cè)由于染色體同源引起的長(zhǎng)片段同源性（LCSH），2種異常都增加常染色體隱性風(fēng)險(xiǎn)。

芯片分辨率取決于探針的種類(lèi)、數(shù)量以及探針在基因組的分布情況［31］。細(xì)菌人工染色體探針比寡核苷酸探針（應(yīng)用于寡核苷酸或單核苷酸多態(tài)性芯片）而言更長(zhǎng)（BACs 為75 000～150 000 個(gè)堿基，寡核苷酸多為50～60個(gè)堿基）。這個(gè)差異導(dǎo)致了BAC芯片對(duì)拷貝數(shù)變異檢測(cè)的特異性相對(duì)較低。在寡核苷酸芯片中使用更高的探針密度能通過(guò)多個(gè)相連的探針評(píng)估拷貝數(shù)，增加檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。寡核苷酸芯片相對(duì)于BAC 芯片具有更高的可重復(fù)性和更少實(shí)驗(yàn)間差異的特點(diǎn)［31］。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）微陣列也能提供全基因組拷貝數(shù)分析。此外，SNP 芯片能檢測(cè)例如片段性染色體同源這一類(lèi)的“拷貝數(shù)中立”異常；此類(lèi)LCSH 會(huì)引起病變、先天性畸形或認(rèn)知障礙［32，33］。SNP芯片正被越來(lái)越多地應(yīng)用于認(rèn)知障礙或發(fā)育遲緩伴或不伴有并發(fā)畸形的診斷［9，11］。

在下CMA 檢測(cè)醫(yī)囑時(shí)，臨床醫(yī)生需了解不同的檢測(cè)平臺(tái)和它們的局限性，需咨詢(xún)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室芯片是否涵蓋目的區(qū)域（例如端粒，X 染色體，常見(jiàn)微缺失區(qū)域）。臨床醫(yī)生還需了解發(fā)現(xiàn)異常結(jié)果后，何種后續(xù)檢測(cè)能被使用。另外，對(duì)于缺失或復(fù)制的情況，應(yīng)進(jìn)行對(duì)父、母親的檢測(cè)（FISH 或有絲分裂中期染色體檢測(cè)）以甄別插入或遺傳性復(fù)制引起的染色體重組。此類(lèi)家庭雖然存在幾率低，但復(fù)發(fā)率高達(dá)50%。隨著診斷檢測(cè)手段的增加，人們開(kāi)始了解更多可能的以及過(guò)去未曾預(yù)料到的檢測(cè)結(jié)果。比較基因組雜交芯片以及我們現(xiàn)在了解的良性拷貝數(shù)變異就是這樣的例子。超過(guò)75間實(shí)驗(yàn)室組成了一個(gè)國(guó)際協(xié)會(huì)來(lái)解答一些關(guān)于芯片檢測(cè)的問(wèn)題。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞基因組芯片協(xié)會(huì)（ISCA 協(xié)會(huì)，https：／／isca.genetics.emory.edu／iscaBrowser／）致力于標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一CGH 檢測(cè)結(jié)果的匯報(bào)和分類(lèi)，包括病理性和良性的，以便為臨床醫(yī)生提供最準(zhǔn)確和最新的信息［14］。目前有幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可供參考基因位點(diǎn)及功能：拷貝數(shù)變異和最新的病變信息有加州大學(xué)圣塔科魯茲分校數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.genome.uscs.edu）、多倫多基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù) p pj g variation／），DECIPHER （http：／／www.sanger.ac.uk／PostGenomics／decip）和ECARUCA［34］。如前所述，決定使用CMA 檢測(cè)的臨床醫(yī)生需了解CMA的改進(jìn)及局限性。CGH 芯片不能檢測(cè)到易位、倒位平衡染色體重組或是鑒別染色體三體和羅伯遜平衡易位［13，35，36］。如使用了不當(dāng)?shù)男詣e 作為對(duì) 照，一些非整倍性例如XYY 會(huì)被漏檢［31］。由于芯片涵蓋范圍、標(biāo)志染色體組成情況以及標(biāo)志染色體上特定染色體成分的差異，一些標(biāo)志染色體也會(huì)被漏檢。有報(bào)道顯示此檢測(cè)可被應(yīng)用于嵌合體，但因準(zhǔn)確率較低［37］而受到質(zhì)疑［35，36］。近 期Scott等［38］提 示 帶 有多余染色體的嵌合體有10%能被檢出，帶有缺失或染色體片段重復(fù)的嵌合體能有20%～30%的檢出率。這些研究結(jié)果有待驗(yàn)證。有時(shí)當(dāng)親本樣品缺失或數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)不全會(huì)影響到對(duì)某些罕見(jiàn)拷貝數(shù)變異的詮釋?zhuān)夷承┪㈥嚵袡z測(cè)不能檢出三倍體。

微陣列技術(shù)檢測(cè)不適用于快速檢測(cè) （例如STAT 新生兒分析），尤其是疑似染色體三體的情況。目前一個(gè)STAT G 顯帶染色體分析只需要48小時(shí)。應(yīng)用CGH 芯片，僅雜交一步就需要48 小時(shí)。完成芯片檢測(cè)一般需要3～5 天，分析、整合FISH 結(jié)果（研發(fā)一個(gè)新探針需要幾周時(shí)間）、分析患者樣品以及最終得出結(jié)論則需要更長(zhǎng)時(shí)間。

盡管微陣列是有力的診斷染色體拷貝數(shù)變異的工具，但該類(lèi)檢測(cè)并不適用于所有的一線檢測(cè)。例如，傳統(tǒng)核型分析更適用于常見(jiàn)的疑似非整倍體（如21三體、18三體或性染色體非整倍性）。在診斷如Williams綜合征一類(lèi)研究非常完全的綜合征，利用單探針FISH 會(huì)更加經(jīng)濟(jì)有效。CMA 不應(yīng)被用于家族性染色體重組無(wú)癥狀個(gè)體或多次流產(chǎn)個(gè)體［14］。最后，CMA 不能檢出低水平嵌合體或是多倍體。

5 推薦指南

5.1 在下列出生后個(gè)體評(píng)估中推薦使用細(xì)胞遺傳微陣列檢測(cè)（CMA）作為一線檢測(cè)手段：

①不符合常見(jiàn)遺傳綜合征的多種畸形；

②非綜合征型的發(fā)育遲緩／智力障礙；

③自閉癥癥候群。

5.2 推薦使用CMA 對(duì)于某些生長(zhǎng)遲緩，言語(yǔ)發(fā)育遲緩或其他罕見(jiàn)癥狀的患兒進(jìn)行進(jìn)一步研究檢測(cè)特別是前瞻性研究和后繼分析。

5.3 對(duì)于使用CMA 檢測(cè)出的染色體不平衡重組，推薦有效的隨訪檢查，可以進(jìn)行對(duì)患者及親本的細(xì)胞遺傳學(xué)／FISH 檢查，臨床遺傳評(píng)估及咨詢(xún)服務(wù)。

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