中藥提取物對雞免疫調節(jié)作用的研究

柳風祥，徐?；?/p>

（1.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018；2.山東農業(yè)大學水利土木工程學院，山東泰安271018）

中草藥制劑具有安全、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點［1］，在動物疾病的防治中起到越來越大的作用。研究表明，某些中藥具有免疫增強作用，能調節(jié)機體的免疫機能，影響網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)、巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞以及DNA、RNA、蛋白質的合成、抗體的合成［2－5］，并能使環(huán)磷酰胺所造成的免疫抑制轉至正常水平。中藥的活性成分很多，不同溶劑提取得到不同的活性成分，有水溶性的，有脂溶性的。本研究是在前期篩選中藥配方的基礎上以REV 為免疫抑制因子建立試驗動物模型，對不同提取方法的中藥制劑進行研究，觀察對免疫抑制雞NDV、H5－AIV 抗體水平和免疫器官重量的影響，為研究中藥的免疫增強作用和對各種原因引起的免疫抑制機理與防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復方中藥組成和提取方法

黃芪（Radix Astragali）、黨參（Radix Codonopis）、淫羊藿（Herba Epimedii）、甘草（Radix Glycyrrizae）均購自泰安市藥材公司，經(jīng)山東省獸藥監(jiān)察所鑒定。

試驗中藥物由40%黃芪、25%黨參、25%淫羊藿、10%甘草混合組成復方中藥，加8倍量的自來水浸泡過夜，煮沸2h后過濾，濾渣再加5倍量自來水煮沸2h過濾，合并兩次濾液，煮沸去水濃縮至含中藥材1g／mL，得中藥提取物ACEG（以各中藥英語單詞第一個字母表示）。為了比較中藥中水溶性或脂溶性成分的藥理活性，將復方中藥混合物ACEG先用乙醚浸泡，每天攪拌2 次，1 周后，過濾。將濾液中溶劑揮發(fā)后，加葡萄糖攪拌均勻，干燥，粉碎，制成含中藥材1g／g，該提取物稱之為ACEG－E。乙醚浸出后的藥材，提取方法和中藥材含量同上述水提取物的提取方法，該提取物稱之為ACEG－W。

1.2 免疫抑制狀態(tài)的誘發(fā)

REV－C99－p3株，為本實驗室保存的一株經(jīng)分子克隆化的REV 毒株［6］，1日齡雛雞大腿內側肌肉接種REV 病毒稀釋液（500TCID50／只）。

1.3 動物試驗設計

150只海藍褐公雞，隨機分為5組，每組30只。1組為不接種病毒對照組，2～5 組為接種REV 誘發(fā)免疫抑制組。2 組只接種REV，不添加任何藥物，3組和5組分別從1日齡起在飲水中按2%濃度添加提取物ACEG 和ACEG－W，自由飲水，直至試驗結束。4 組按4%的濃度在飼料中添加提取物ACEG－E，拌料，自由采食，直至試驗結束。

7日齡時所有雞點眼接種Lasota株NDV 弱毒疫苗，同時肌肉接種NDV 滅活疫苗（英特威公司生產(chǎn)）和H5－AIV 滅活疫苗（齊魯動物保健品有限公司生產(chǎn)），其中H5－AIV 為抗原濃縮型疫苗。分別在第4，5，6W 采血檢測對NDV 和H5－AIV 的血凝抑制（HI）抗體水平。49日齡剖殺所有雞統(tǒng)計各組體重和免疫器官重量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

以試驗處理（組）為固定效應，用SAS8.2軟件包的GLM 程序對各試驗指標進行分析，結果用平均值±標準誤差表示，組間差異性用鄧肯氏多重比較進行分析。

2 結果

2.1 不同提取法中藥提取物對雞的免疫調節(jié)作用

表1中的試驗結果顯示，REV 極顯著地誘發(fā)了試驗動物的對NDV 滅活疫苗的抗體反應（P＜0.01）；添加中藥水提取物（ACEG）和乙醚提取后水提取物（ACEG－W）組對NDV 滅活疫苗免疫后4w、5w、6w 的HI抗體滴度具有極顯著的增強作用（相對于2組，P＜0.01），但仍然低于1組；而乙醚提取物組（ACEG－E）與2組比較差異不顯著（P＞0.05）。ACEG 與ACEG－W 比較差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，ACEG 和ACEG－W 都具有免疫增強作用，而ACEGPE沒有免疫增強活性，黃芪、黨參、淫羊藿和甘草的免疫增強活性成分在水相。

表2中的試驗結果顯示，REV 同樣極顯著地誘發(fā)了試驗動物的對H5－AIV 滅活疫苗的抗體反應（P＜0.01）；添加中藥水提取物（ACEG）組對H5－AIV 滅活疫苗免疫后4w、5w、6w 的HI抗體滴度具有極顯著的增強作用（相對于2組，P＜0.01），但仍然顯著低于未免疫抑制組（1組）；乙醚提取后水提?。ˋCEG－W）組在5w 和6w 對H5－AIV 滅活疫苗顯示明顯的免疫增強作用（P＜0.01，相對于2組），但仍然低于未免疫抑制組1組。而乙醚提取物（ACEG－E）組與2 組比較差異不顯著（P＞0.05）。ACEG 與ACEG－W 比較差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，ACEG 和ACEG－W 都具有免疫增強作用，而ACEG－E 沒有免疫增強活性，ACEG 的免疫增強活性成分在水相。

表1 中藥水溶性成分和脂溶性成分對雞NDV HI抗體滴度的影響Table 1 Influence of herbal extraction of water－soluble and fat－soluble components on NDV HI titer（Log2）of chickens

表2 中藥水溶性成分和脂溶性成分對雞H5－AIV HI抗體滴度的影響Table 2 Influence of herbal extraction of water－soluble and fat－soluble components on NDV HI titer（Log2）of chickens

2.2 不同提取方法中藥提取物對雞體重、胸腺、法氏囊和脾臟重量的影響

表3試驗結果表明，接種免疫抑制病毒REV組與未接種組比較顯著抑制雞的體重（P＜0.05），隨飲水添加ACEG、ACEG－E 和ACEG－W 組與免疫抑制組體重比較差異不顯著（P＞0.05），免疫抑制添加藥物組（ACEG、ACEG－E 和ACEG－W）之間比較差異也不顯著（P＞0.05），但免疫抑制用藥組（ACEG）體重較大（473g），說明三種中藥提取物對免疫抑制動物的體重沒有影響。

REV 同樣誘發(fā)了免疫器官的萎縮，對照組與免疫抑制不用藥物組比較差異極顯著（P＜0.01）；試驗數(shù)據(jù)顯示，ACEG 和ACEG－W 組可顯著增加免疫器官的重量（P＜0.05），但免疫器官的重量仍低于未免疫抑制組。ACEG－E 對試驗動物的免疫器官沒有影響（P＞0.05）。說明ACEG 和ACEG－W有促進免疫器官生長的作用。

表3 中藥水溶性成分和脂溶性成分對雞體重、胸腺、法氏囊和脾臟重量的影響Table 3 Influence of herbal extraction of water－soluble and fat－soluble components on body weight and immune organs weight of chickens

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學《黃帝內經(jīng)》說：“邪之所湊，其氣必虛”，“正氣存內，邪不可干”。說明無論什么疾病，都是正邪斗爭的具體體現(xiàn)。如果機體真氣（即正氣，為人體生命活動的物質基礎，又是動力的源泉）虛衰，不足以抵御趁虛而入的外邪，由此而變生百病。如果真氣充足，邪氣就不會侵入，機體生理功能旺盛，疾病也就不會發(fā)生。因此中醫(yī)提出了“扶正祛邪”的基本治療法則，按現(xiàn)代免疫學理論可稱為“提高機體免疫功能”，這也體現(xiàn)了現(xiàn)代免疫學的樸素原理。雞生產(chǎn)性能和疫病的防治是目前養(yǎng)雞業(yè)公認的重點工作，也是關系到養(yǎng)殖戶或企業(yè)經(jīng)濟效益好壞的重要指標之一。隨著集約化程度的提高以及多重因素的交織，往往導致疫苗接種雞后應答能力下降，使機體的抗病力下降；中草藥組成的免疫增強劑就是運用扶正祛邪和扶正固本的理論，結合現(xiàn)代醫(yī)學的新技術，來提高雞免疫系統(tǒng)的免疫功能，增強抗病力，從而達到防治雞疫病的目的。

黃芪具有補氣固表，托毒排膿，生肌等功能；黨參具有補氣、益血、生津的功能；淫羊藿具有補肝腎、強筋骨、助陽益精、祛風除濕等功能。現(xiàn)代研究表明，中藥的活性成分具有增加免疫器官重量、促進外周血、脾臟淋巴細胞增殖、提高雛雞新城疫抗體效價的作用［3－6］。本試驗用黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成復方中藥，并通過一定提取方法研究中藥水溶性成分和脂溶性成分對體液免疫和免疫器官的影響。試驗結果顯示（表1和表2），由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的復方中藥，其水溶性成分和乙醚提取后再用水提取的成分具有明顯增強由REV 誘發(fā)的免疫抑制雞的NDV 和H5－AIV HI抗體水平，而由同樣中藥組成的乙醚提取成分則沒有免疫增強作用，說明具有免疫增強作用的成分在水相，這和胡元亮、儲岳峰、王德云的研究結果一致。中藥水提取物還能提高REV 免疫抑制雞NDV 和H5－AIV 的抗體水平，對于這方面的研究以前沒有見到報道。

黃芪等提取物能提高肉仔雞生長性能，促進免疫器官發(fā)育，增強免疫活性，增加免疫器官的重量［7－9］。形態(tài)學研究表明［10］，黃芪多糖（APS）可使小鼠脾臟增大，在光鏡下觀察，腹腔注射APS后小鼠脾臟中血髓增大、淋巴結增多。在電鏡下觀察，用過APS的小鼠脾臟中有大量成漿細胞增生，以成熟漿細胞為主，核內染色質凝集成塊，胞漿內有大量粗面內質網(wǎng)，內質網(wǎng)呈不同程度的擴張，腔內充滿中等或低電子密度的抗體蛋白質。本試驗中中藥水溶性成分具有明顯的增加REV 誘發(fā)的免疫抑制雞的胸腺、法氏囊和脾臟的重量，說明該中藥組合的水溶性成分具有促進免疫器官生長發(fā)育的作用；但是由同樣中藥組成的乙醚提取物對REV 誘發(fā)的免疫抑制雞的免疫器官沒用影響。說明該中藥組合的水溶性成分對REV 誘發(fā)的免疫抑制雞的免疫器官的發(fā)育有促進作用，具有促進作用的成分在水相。

研究表明，中藥水溶性提取物主要含有多糖、鞣酸、苷類、氨基酸、微量元素、胡蘿卜素葉酸等，其中多糖是主要的免疫活性成分，具有免疫增強作用［11－12］。本試驗中不論是直接用自來水提取還是用乙醚提取后再用自來水提取的藥物都具有免疫增強作用，主要是由于水提取物中含有多糖的原因，多糖不溶于乙醚，所以乙醚提取物沒有多糖，其免疫活性最差，所以對REV 造成的免疫抑制增強效果最差。從試驗結果中發(fā)現(xiàn)，三種中藥提取物中，水提取物的免疫增強效果比較明顯，而用乙醚提取的效果最差，說明溶于水的黃芪多糖、黨參多糖、淫羊藿多糖和甘草多糖起到了免疫增強作用。

4 結論

REV 對雛雞的體重、免疫器官重量造成免疫抑制。中藥的水溶性成分和乙醚提取后再用水提取的成分具有明顯增強免疫抑制雞的抗體水平，而由同樣中藥組成的乙醚提取成分則沒有免疫增強作用。中藥水溶性成分可顯著增加免疫抑制雞的胸腺、法氏囊和脾臟的重量，乙醚提取物對免疫抑制雞的免疫器官沒有影響。

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