山羊絨毛干中線粒體DNA和核DNA的提取與PCR擴(kuò)增

耿榮慶，周光現(xiàn)，韓旭峰，李 偉，李碧波，王小龍，陳玉林＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2.鹽城師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城224051）

動(dòng)物毛發(fā)中不僅含有較為豐富的線粒體DNA（mtDNA），而且存在微量的核DNA（nuDNA）［1－3］。因此，毛發(fā)可以作為在DNA 分子水平上開(kāi)展物種或個(gè)體鑒別、遺傳多樣性評(píng)估、分子進(jìn)化分析等方面研究的重要生物材料。

羊絨是生長(zhǎng)在山羊外表皮層，掩在山羊粗毛根部的一層薄薄的細(xì)絨，屬于稀有的特種動(dòng)物纖維。羊絨來(lái)源豐富，可以在活體上通過(guò)非損傷性取樣直接獲得，是一種非常易于采集、運(yùn)輸和保存的樣品。有關(guān)羊絨DNA 的研究主要集中在運(yùn)用mtDNA 標(biāo)記鑒別山羊絨與綿羊毛方面，尚無(wú)nuDNA 提取與應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道［4－7］。本文探索從山羊絨毛干中樣品中提取DNA（包括mtDNA 和nuDNA）的簡(jiǎn)便方法，結(jié)合采用PCR 擴(kuò)增和電泳檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證其可行性，為拓展羊絨樣品在個(gè)體識(shí)別、遺傳資源評(píng)價(jià)、分子進(jìn)化和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛樣的采集與處理

用剪刀剪取陜北白絨山羊和太行黑山羊不同個(gè)體的體側(cè)部毛樣（不含毛囊）各8份，裝入樣品袋并編號(hào)，常溫保存3d后－20 ℃冷凍備用。

1.2 羊絨毛干DNA 提取

從保存的16份毛樣中分別取出一小份，將每份樣品放入高壓滅菌后的玻璃燒杯中；往每個(gè)裝有毛樣的燒杯中加入20mL 70%乙醇溶液，用鑷子夾住毛樣洗滌1～2min，夾出毛樣用吸水紙吸干乙醇溶液；再將毛樣用蒸餾水洗滌3次，夾出毛樣用吸水紙吸去水份。從每份洗滌干凈后的毛樣中剔除羊毛，只保留羊絨，再將羊絨剪碎（約1～2mm）備用。

每份羊絨準(zhǔn)確稱取0.0001g，放入高壓滅菌后的PCR 管中，加入50μL DNA 提取液。每100μL DNA 提取液包括10×PCR 緩沖液10μL（pH 8.4的Tris－HCl 100mM；KCl 500mM）、25mM MgCl28μL、10mg／mL 蛋白酶K 2μL 以及ddH2O 補(bǔ)足體積至80μL。

在PCR 擴(kuò)增儀上設(shè)置單個(gè)循環(huán)程序（65 ℃30 min，95 ℃15min，4 ℃10 min），然后將含羊絨和DNA 提取液的PCR 管在PCR 擴(kuò)增儀上運(yùn)行該程序。程序運(yùn)行結(jié)束后將PCR 管瞬時(shí)離心，Thermo NanoDrop ND－1000核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定溶液中的DNA 濃度，樣品置于－20 ℃保存。

1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與檢測(cè)

根據(jù)Kocher等［8］報(bào)道的通用引物，優(yōu)化設(shè)計(jì)后用于擴(kuò)增線粒體基因組上的12SrRNA 基因片段（目標(biāo)大小為439bp），上、下游引物序列分別為5′－AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT－3′和5′－GAGGGTGACGGGCGGTGTGT－3′。

根據(jù)Klungland等［9］發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增核基因組上的MC1R 基因片段（目標(biāo)大小為267bp），上、下游引物序列分別為5′－CTCGTTGGCCTCTTCATAGC－3′和5′－GAAGTTCTTGAA GATGCAGCC－3′。

PCR 擴(kuò)增體系為25μL，其中10×buffer 2.5 μL，25mmol／L MgCl22μL，10 mmol／L dNTP 2 μL，10pmol／L 引物各1μL，5 U／μL Taq 酶0.3 μL，DNA 模板1μL，剩余體積用滅菌超純水補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增條件為：94℃3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

取2μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有特異性目標(biāo)條帶后，采用凝膠回收純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）純化，送南京金斯瑞生物科技有限公司雙向測(cè)序，結(jié)合觀察測(cè)序峰圖人工核對(duì)測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊絨毛干DNA 提取結(jié)果

通過(guò)將清洗干凈的羊絨無(wú)毛囊剪碎至1～2 mm 長(zhǎng)度，在65℃溫度和PCR 緩沖液作用條件下，一定濃度的蛋白酶K 就能夠消化羊絨，使其釋放出DNA 分子。核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)表明，從16個(gè)羊絨中都能夠提取出一定量的DNA，且不同個(gè)體間的提取總量差異不顯著，平均DNA 含量約為59.43±1.96ng／mL。

2.2 PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)情況

從線粒體12SrRNA 基因擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖1），從16個(gè)DNA 樣品中都能夠特異性地?cái)U(kuò)增出明亮、單一的條帶，而且與預(yù)期的大小一致。從核基因組的MC1R 基因擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖2），從16 個(gè)DNA 樣品中都能夠特異性地?cái)U(kuò)增出明亮、單一的目標(biāo)條帶，而且與預(yù)期的大小一致。

將擴(kuò)增的12SrRNA 和MC1R 基因片段回收純化后，直接進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果分別與山羊12SrRNA 和MC1R 基因全序列比對(duì)表明，所擴(kuò)增的條帶即為目標(biāo)基因片段。

圖1 12SrRNA 基因擴(kuò)增片段的電泳圖Fig.1 Electrophoresis picture of amplification fragment of 12SrDNA gene

圖2 MC1R 基因擴(kuò)增片段的電泳圖Fig.2 Electrophoresis picture of amplification fragment of MC1Rgene

3 討論

動(dòng)物毛發(fā)由毛干和毛根構(gòu)成，其毛干由髓質(zhì)層、皮質(zhì)層和角質(zhì)層共同組成。毛干中90%以上是由蛋白質(zhì)組成，DNA 含量極低，導(dǎo)致DNA 提取與純化困難，從而使得毛干這種極易取得的生物樣品在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域得不到有效利用。綜合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道表明［10－17］，毛干DNA 提取的主要方法包括經(jīng)典的酚－氯仿法、Chelex 100法、試劑盒法、PCR緩沖液－蛋白酶K 法以及多種組合方法。除了PCR緩沖液－蛋白酶K 法以外，其它方法都涉及到純化、富集等步驟，比較繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，甚至部分方法試劑費(fèi)用也相對(duì)較為昂貴。特別是由于多次使用各種化學(xué)試劑，會(huì)影響到后續(xù)PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)穩(wěn)定性較差，使相關(guān)分子生物學(xué)試驗(yàn)受到很大的限制。

本試驗(yàn)建立了一種從常溫保存的山羊絨毛干中提取總DNA 的穩(wěn)定試驗(yàn)流程，以PCR 緩沖液、MgCl2溶液和蛋白酶K 為裂解提取液，整個(gè)DNA的獲取過(guò)程在PCR 擴(kuò)增儀上完成，裂解后的溶液直接作為模板用于PCR 反應(yīng)，具有方便、快速、高效的特點(diǎn)。由于所用的裂解提取液和后續(xù)PCR 擴(kuò)增體系的成份相似，其中含有的Tris堿和PCR 緩沖液的pH 值能夠在DNA 提取過(guò)程中起到保護(hù)DNA、防止降解的作用。由于簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，大大減少了DNA 在操作過(guò)程中的損失，提高了DNA 得率。此外，在提取之前的樣品處理過(guò)程中，首先要用70%乙醇溶液漂洗去羊絨上附著的皮屑、油脂和雜物，防止提取出皮屑樣品的DNA，然后再用蒸餾水洗滌羊絨3 次，以消除殘留乙醇對(duì)DNA 的損傷。因此，通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證表明，建立的提取方法不僅能夠從羊絨毛干中提取出mtDNA 和nuDNA，而且能夠有效地進(jìn)行基因的擴(kuò)增，將大大擴(kuò)展無(wú)毛囊的羊絨作為生物材料的用途。

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