高郵鴨和金定鴨胸肌早期發(fā)育及MyoD1基因表達(dá)分析

朱春紅，陶志云，宋 遲，宋衛(wèi)濤，胡 艷，束婧婷，章雙杰，李慧芳

（江蘇省家禽科學(xué)研究所生物技術(shù)研究室，江蘇揚州225125）

胚胎以及成體骨骼肌發(fā)育過程中均依賴于生肌調(diào)節(jié)因子（Myogenic regulatory factors，MRFs）家族的精準(zhǔn)調(diào)控，MRFs家族成員包括肌分化因子MyoD1、肌細(xì)胞生成素MyoG （Myogenin）、生肌決定因子Myf5和Myf6［1－3］，調(diào)控從前體肌細(xì)胞的定型、增殖以及肌纖維的形成，直到個體出生后肌肉的成熟和功能的完善等肌肉發(fā)生發(fā)育的各個環(huán)節(jié)，且其功能與之在骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá)時序性關(guān)系密切［4］。MRFs家族在骨骼肌細(xì)胞的決定和分化中都是必需的，但其在肌肉發(fā)育過程中的作用不同，在肌肉發(fā)育初級階段，MyoD1和Myf5主要在成肌前體細(xì)胞的命運決定和成肌細(xì)胞增殖中起作用［3］，而肌肉發(fā)育次級階段中MyoG和Myf6 基因則在成肌細(xì)胞的融合和分化中起作用。目前國內(nèi)外對家禽生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族的研究主要集中于其基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀或者繁殖性狀的相關(guān)性上［5－7］，而對其表達(dá)模式的研究相對較少。

本研究以高郵鴨和金定鴨為研究對象，采用qPCR 技術(shù)研究不同品種鴨胚胎期以及初生期胸肌中MyoD1基因的發(fā)育性表達(dá)變化，并分析MyoD1基因的表達(dá)變化與骨骼肌發(fā)育變化的相關(guān)性，以探索其在胸肌發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在相同日糧水平以及相似飼養(yǎng)條件下，收集高郵鴨和金定鴨種蛋，孵化前進(jìn)行稱重、消毒和編號，品種內(nèi)蛋重變異系數(shù)在2%以內(nèi)。2組種蛋隨機(jī)置入同一孵化箱，在相同條件下（溫度為37.5～37.8℃，相對濕度為50%～70%）同時孵化。種蛋入孵后24h設(shè)定為1胚齡，分別于6個時間點（13、17、21、25、27胚齡和出雛后7日齡）采集胸肌樣品，稱重后，置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入－80 ℃冰箱保存。各品種各時間點采集16個個體，公母各半。

1.2 主要試劑和儀器

TRNzol－A＋總RNA 提取試劑（DP421）、SuperReal PreMix（SYBR Green）（FP204－01）、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit，KR103－04）、pGM－T 克隆試劑盒（VT302－02）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，DP103－02）、DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒（TIANquick Midi Purification Kit，DP204－02）購自TIANGEN 公司；DNA Marker DL2000 為 TakaRa 公司產(chǎn)品。9700PCR 儀和Mx3000P熒光定量PCR 儀（愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)上海有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500）；紫外分光光度計（GeneQuant II，Pharmacia Biotech）。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA 提取和cDNA 合成 肌肉總RNA提取按TRNzol－A＋總RNA 提取試劑的說明書進(jìn)行。RNA 樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，保證RNA 樣品質(zhì)量可靠，計算樣品總RNA 濃度。cDNA 第1鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進(jìn)行，用持家基因GAPDH 檢測cDNA 合成質(zhì)量以及是否有基因組DNA 殘留。

1.3.2 引物設(shè)計、目的片段的克隆 根據(jù)Gen－Bank 中鴨MyoD1 mRNA 序列（登錄號為：FJ374143.1）采用Primer Premier 5.0軟件在外顯子區(qū)設(shè)計PCR 引物，并交由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為MyoD1－F：5＇－AAGGCGTGCAAGAGGAAGAC－3＇，MyoD1－R：5＇－TGGTTGGGGTTGGTGGA－3＇，擴(kuò)增片段長度為131bp；PCR 反應(yīng)體系：PreMIX 10μL，上下游引物各0.5 μL （10 μmol／L），模板cDNA 2 μL，RNase－Free ddH2O 7μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min；95℃30 s，55 ℃30s，72 ℃1min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠鑒定后，用DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒純化回收目的片段，與pGM－T載體相連接，然后轉(zhuǎn)化Eschericbia.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子于含氨芐抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200r／min振搖培養(yǎng)過夜，用PCR 鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行測序。

1.3.3 熒光實時定量PCR［8］所用qPCR 采用SYBR Green I法，20μL 反應(yīng)體系如下：RealMasterMix（SYBR GreenI）9μL （2.5×Real Master Mix，20× SYBRsolution），上下游引物各0.5μL（10μmol／L），cDNA 模板2μL，加ddH2O 8μL 補足20μL。反應(yīng)條件：按試劑盒說明，95 ℃2 min，94 ℃20s；60 ℃20s、72 ℃20s共40 個循環(huán)，擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以0.5℃／30s的速率從60 ℃遞增到95 ℃。每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品（各重復(fù)3次）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

（1）標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)計算：樣本分子量＝堿基數(shù)×324；拷貝數(shù)（copies／uL）＝標(biāo)準(zhǔn)品濃度／樣本分子量×6×1014。

（2）根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將得到的未知樣本Ct值代入線性方程即可得出未知樣本拷貝數(shù)。

運用SPSS 20.0軟件中One－way ANOVA 和Bivariate Correlation分析胸肌中MyoD1mRNA 表達(dá)量與胸肌重的相關(guān)性。P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鴨品種發(fā)育早期胸肌組織中MyoD1mRNA 表達(dá)

鴨胚胎期和初生早期胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)結(jié)果見圖1。由圖1可見，MyoD1mRNA 在高郵鴨和金定鴨的胸肌組織不同發(fā)育時段均有所表達(dá)，且在上述兩個品種胸肌組織中表達(dá)模式相似，均呈“波浪形”，在13胚齡時表達(dá)量相對較高，17胚齡時下降，21胚齡時表達(dá)量上升，隨后下降，出雛后又維持較高水平，高郵鴨27胚齡及金定鴨25胚齡時胸肌組織中的表達(dá)量極顯著水平低于金定鴨13胚齡的表達(dá)量（P＜0.01）。

不同鴨品種間表達(dá)量分析比較發(fā)現(xiàn)，除了在25胚齡時金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 表達(dá)量稍低于高郵鴨，在其他所檢測的胚齡／日齡中，金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 表達(dá)量均高于高郵鴨胸肌中的表達(dá)量，但表達(dá)量在品種間的差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 鴨發(fā)育早期胸肌MyoD1 mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重量變化的二元變量相關(guān)性

高郵鴨和金定鴨發(fā)育早期胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重量發(fā)育的二元變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高郵鴨胸肌中MyoD1 mRNA 的表達(dá)與胚重以及胸肌重的發(fā)育變化不相關(guān)；而金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重的發(fā)育變化表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)（P＝0.048），與胸肌重發(fā)育變化呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)（P＝0.006），金定母鴨的相關(guān)水平要高于公鴨。具體結(jié)果如表1所示。

圖1 高郵鴨和金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 發(fā)育性表達(dá)變化Fig.1 Expression change of MyoD1mRNA in pectorales of Gaoyou duck and Jinding duck

表1 鴨發(fā)育早期胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重發(fā)育變化的二元變量相關(guān)性分析Table 1 Bivariate correlation analysis of MyoD1mRNA expression and weight development changes of embryo and pectorales

3 討論

國內(nèi)有重要經(jīng)濟(jì)價值的兩個地方鴨品種－高郵鴨和金定鴨在骨骼肌發(fā)育等相關(guān)性狀上存在明顯表型差異，是研究肌肉生長發(fā)育的理想動物模型［8］，因此本研究選用上述兩個品種進(jìn)行鴨發(fā)育早期胸肌組織中MyoD1 基因的表達(dá)差異分析。MyoD1 mRNA 在不同品種鴨胸肌的表達(dá)變化表現(xiàn)出一致的規(guī)律性，呈“波浪型”，在13胚齡時表達(dá)量相對較高，17胚齡時下降，21胚齡時上升到最高，隨后下降，出雛后又維持較高水平。在鴨出殼后的表達(dá)量仍維持一定的表達(dá)水平，推測MyoD1 基因在胚胎形成后肌肉的發(fā)育過程中也起重要作用，一方面胚胎形成后仍有部分成肌細(xì)胞處于增殖和早期決定階段，需要通過MyoD1基因以及Myf5基因的表達(dá)來實現(xiàn)這些細(xì)胞的早期命運決定；另一方面，這可能與MRFs家族各成員間的復(fù)雜作用關(guān)系有關(guān)［9］。

金定鴨胸肌中不同胚齡間的表達(dá)差異水平較高郵鴨大，金定鴨除25 胚齡外，其他胚齡／日齡中MyoD1mRNA 的表達(dá)量均高于高郵鴨。Cinar報道在6月齡皮特蘭豬和杜洛克豬腰肌中MyoD1 mRNA 表達(dá)量無顯著的品種差異［10］，這可能和其只檢測發(fā)育過程中的一個時間點有關(guān)。另外，MyoD1基因表達(dá)量和胚重、胸肌發(fā)育變化的二元變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重發(fā)育負(fù)線性相關(guān)水平分別達(dá)顯著和極顯著水平，而在高郵鴨中未檢測出顯著水平的相關(guān)，這可能與MyoD1 基因在不同品種胸肌組織中的不同水平有關(guān)。Cinar等［10］利用主成分分析方法分析MyoD1基因?qū)?月齡皮特蘭豬和杜洛克豬肌肉發(fā)育影響，結(jié)果表明MyoD1 基因的表達(dá)對上述兩個豬品種腰肌肌肉生長的權(quán)重值相當(dāng)，本試驗結(jié)果和Cinar的研究結(jié)果存在差異，這一差異可能是由于物種（家禽／哺乳動物）差異所致。

MyoD1基因在鴨胚以及鴨初生期的發(fā)育性表達(dá)分析研究結(jié)果顯示，上述基因不但在胚胎期鴨早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用，且在鴨新生早期的發(fā)育中也發(fā)揮重要作用。本試驗對MyoD1基因表達(dá)規(guī)律及表達(dá)模式的研究，為研究鴨鴨骨骼肌生長發(fā)育規(guī)律提供了理論基礎(chǔ)，同時也為提高地方品種鴨產(chǎn)肉性能和提高肉品質(zhì)提供新的育種信息。

［1］Davis R L，Weintraub H，Lassa A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts［J］.Cell，1987，51（6）：987－1 000.

［2］Braun T，Busebhansen－Denker G，Bober E，et al.A novel human muscle faetor relate to but distinct from MyoDl induces myogenic conversion in 10TI／2fibroblasts［J］.EMBO J，1989，8（3）：701－709.

［3］Braun T，Bober E，Busebhansen－Denker G，et al.Differential expression of myogenic determination genes in muscel cells：possible autoactivation by the Myf gene products［J］.EMBO J，1989，8（12）：3 617－3 625.

［4］孫文浩，朱 慶.生肌決定因子Myf5基因研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（7）：28－30.

［5］孫文浩，朱 慶，蔣小松，等.雞Myf6基因遺傳多態(tài)性及遺傳效應(yīng)研究［J］.遺傳，2008，30（1）：71－76.

［6］王 瓊，朱 慶，劉益平，等.MyoG 基因多態(tài)性與優(yōu)質(zhì)肉雞屠宰性狀和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析［J］.遺傳，2007，29（9）：1 089－1 096.

［7］寇 潔，李 亮，王繼文.5個鴨品種MyoD 基因外顯子1的多態(tài)性及其與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國畜牧雜志，2011，47（19）：10－12.

［8］朱春紅，徐文娟，胡 艷，等.高郵鴨和金定鴨發(fā)育早期骨骼肌發(fā)育及IGF－IR 基因表達(dá)分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21（2）：192－198.

［9］魏園丁.鴨MyoD1和Myfs基因cos區(qū)克隆及其在肌肉組織中發(fā)育差異性表達(dá)研究［D］.四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［10］Cinar M U，F(xiàn)an H T.The mRNA expression pattern of skeletal muscle regulatory factors in divergent phenotype swine breeds［J］.Kafkas Univ Vet Fak Derg，2012，18（4）：685－690.