結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)進(jìn)展及存在的問題和對策

胡忠義

·專家論壇·

結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)進(jìn)展及存在的問題和對策

胡忠義

結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)研究取得了顯著進(jìn)展,但仍不能滿足臨床診治及防控的需求。一些新的細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)藥敏檢測技術(shù)盡管比傳統(tǒng)的耐藥性檢測方法更加快速和靈敏,但是各種新技術(shù)在臨床應(yīng)用中也存在著不少問題。就這些新技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及可能解決的措施和進(jìn)展情況提出了一些看法,以便促進(jìn)這些新技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

結(jié)核； 抗藥性,細(xì)菌； 微生物敏感性試驗(yàn)

結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)研究雖然經(jīng)過數(shù)十年的努力,取得了顯著進(jìn)展,但仍不能滿足臨床診治的需要［1-2］。筆者就近年來的一些耐藥性測定新技術(shù)、新方法進(jìn)展情況及其在應(yīng)用中存在的問題和可能解決的方法提出一些看法,力圖促進(jìn)這些新技術(shù)的推廣應(yīng)用。

理想的耐藥性檢測新技術(shù)要求

理想的耐藥性檢測新技術(shù)應(yīng)該達(dá)到以下四個(gè)基本要求。

1.快速：總體是越快越好。分子藥敏技術(shù)應(yīng)該當(dāng)天獲得結(jié)果,細(xì)菌學(xué)藥敏檢測希望在1周左右時(shí)間獲得結(jié)果。

2.準(zhǔn)確：準(zhǔn)確性越高越好。其中敏感度應(yīng)該不低于90%,特異度應(yīng)該在95%以上。

3.簡便：操作簡便,步驟少,減少人為因素影響,能夠自動化或半自動化更好。

4.價(jià)廉：價(jià)格低廉,便于基層民眾承受。

當(dāng)前常用耐藥性測定方法存在的問題

一、細(xì)菌學(xué)耐藥性測定方法

1.固體藥敏培養(yǎng)法：絕對濃度法和比例法是目前國內(nèi)外普遍應(yīng)用的結(jié)核病耐藥性測定方法。其主要問題是：需時(shí)久,4周才能獲得結(jié)果；準(zhǔn)確性低,與臨床符合率差；操作繁瑣,傳播風(fēng)險(xiǎn)大。

2.液體藥敏培養(yǎng)法：MGIT-960是國際公認(rèn)的液體培養(yǎng)耐藥性檢測方法,具有快速、準(zhǔn)確、儀器化檢測等優(yōu)點(diǎn),但需特殊儀器設(shè)備,試劑依賴進(jìn)口,費(fèi)用昂貴,限制了其在基層單位的應(yīng)用。

二、分子藥敏檢測

分子藥敏檢測在我國尚處于研究階段,極少數(shù)單位開展臨床應(yīng)用研究,其臨床意義難以定論。

耐藥性檢測新技術(shù)及其存在的問題

一、細(xì)菌學(xué)藥敏檢測技術(shù)及其存在的問題

1.細(xì)胞培養(yǎng)板藥敏檢測技術(shù)：該法在25孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行固體藥敏最小抑菌濃度（MIC）測定,7～10 d可獲得藥敏結(jié)果,具有簡便快速的優(yōu)點(diǎn)［3］,但是由于含藥培養(yǎng)基用量少,分裝制備較為繁瑣,需依賴專用儀器設(shè)備,而且所用的MiddleBrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基價(jià)格較貴,影響了其在基層的推廣應(yīng)用。

2.液體微孔板MIC藥敏檢測：這種方法是在96孔塑料板上進(jìn)行的微量液體藥敏試驗(yàn),7～10 d就可獲得10余種抗結(jié)核藥物的MIC測定結(jié)果。檢測結(jié)果表明,本法簡便快速,敏感度和特異度均可達(dá)90%左右,而且費(fèi)用低廉,很受臨床歡迎［4-5］。存在的問題是液體培養(yǎng)基質(zhì)量直接影響藥敏結(jié)果的時(shí)間,早期結(jié)果觀察存在主觀性,生物安全隱患較大。

3.顯微鏡觀察直接藥敏試驗(yàn)：該法是將液體培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)與倒置顯微鏡觀察技術(shù)相結(jié)合的一種快速耐藥性檢測技術(shù)。由于 Mtb在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)形成索狀結(jié)構(gòu),可以在倒置顯微鏡下觀察到。該法可同步進(jìn)行痰標(biāo)本的快速培養(yǎng)和藥敏檢測,7 d即可獲得診斷和藥敏結(jié)果,尤其是其藥敏檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性可達(dá)95%以上,深受臨床用戶歡迎［6-7］。存在的問題主要是液體培養(yǎng)基質(zhì)量直接影響藥敏結(jié)果的時(shí)間和準(zhǔn)確性,早期結(jié)果觀察時(shí)可能會出現(xiàn)人為因素的影響,質(zhì)量控制較難。另外,每日鏡下觀察,生物安全隱患較大。

4.雙相羅氏培養(yǎng)基藥敏試驗(yàn)：是一種將固體羅氏培養(yǎng)基和液體藥敏培養(yǎng)基結(jié)合為一的快速藥敏檢測技術(shù),具有簡便、準(zhǔn)確、價(jià)廉、不需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)；其藥敏時(shí)間比常規(guī)羅氏藥敏時(shí)間縮短2周,藥敏結(jié)果與MGIT960的符合率達(dá)95%以上,而其成本僅為MGIT960的1/5,因此深受用戶喜愛［8］。但是藥敏早期結(jié)果肉眼不易觀察,需要通過加入顯色劑得以解決。

5.噬菌體擴(kuò)增檢測技術(shù)：該法2～3 d即可獲得藥敏檢測結(jié)果,是目前最快的 Mtb表型藥敏檢測技術(shù)。具有準(zhǔn)確、價(jià)廉、不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)［9-10］。除可用于臨床分離株的耐藥性檢測,也可用于涂陽痰標(biāo)本的耐藥性測定。該法最顯著的優(yōu)勢是生物安全性高,因其結(jié)果是將耐藥菌株裂解。這對實(shí)驗(yàn)室生物安全和降低操作者被感染的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。存在的問題是：操作步驟較多、容易污染和難以進(jìn)行質(zhì)量控制,這些都將影響其推廣應(yīng)用。

二、耐藥性分子藥敏檢測新技術(shù)及其存在的問題

分子藥敏檢測技術(shù)近年來進(jìn)展迅速,其最大優(yōu)點(diǎn)是快速,通常1 d即可獲得藥敏結(jié)果,是WHO重點(diǎn)推薦的結(jié)核病快速藥敏檢測方法。

1.線性探針雜交藥敏檢測技術(shù)：將常見突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針（R探針）和正常序列的探針（S探針）分別固定在硝酸纖維素膜上,與待檢菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。然后加入顯色系統(tǒng),以呈色反應(yīng)判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。若擴(kuò)增產(chǎn)物與S探針雜交陰性,與R探針雜交陽性,則待檢菌株為耐藥株,反之為敏感株。本法快速、靈敏、特異。已有產(chǎn)品上市,可同步檢測利福平和異煙肼的耐藥性。對比結(jié)果表明,本法對利福平耐藥株的陽性檢出率可達(dá)90%,對異煙肼耐藥株的檢出率達(dá)70%以上［11-12］。存在的問題是只能檢出常見的突變位點(diǎn),而且對異煙肼的耐藥性檢出率還需提高。同時(shí)價(jià)格昂貴也是重要問題之一。

2.Xpert Mtb/RIF：該技術(shù)是利用RFP耐藥性相關(guān)基因rpoB特異性結(jié)合的分子信標(biāo)（一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針）來檢測Mtb的rpoB基因上的利福平耐藥決定區(qū)有無突變。如果存在突變,則會影響分子信標(biāo)與靶序列的雜交,使得熒光值下降,通過比較熒光信號的變化檢測利福平的耐藥性［13-14］。其最大優(yōu)點(diǎn)是快速、靈敏,特異度高,但也存不少問題。最主要的是只能檢測RFP一種藥物的耐藥性,敏感度達(dá)90%左右。另外,需要特殊儀器設(shè)備,試劑費(fèi)用也較貴,限制了其在基層的推廣應(yīng)用。

3.基因芯片藥敏檢測技術(shù)：該法快速,從樣品制備到檢測結(jié)果只需4 h；靈敏,可以達(dá)微克、微微克水平。目前國內(nèi)已開發(fā)的產(chǎn)品可同步進(jìn)行Mtb和10多種常見非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定,檢測 Mtb對4種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性［15-16］。存在的問題是：只能檢出常見的突變類型,同時(shí)操作要求很高,儀器試劑較貴,限制了其廣泛應(yīng)用。

4.測序：測序既能確定有無突變及突變部位和性質(zhì),因此是耐藥性測定的金標(biāo)準(zhǔn)方法。方法有Sanger DNA測序和焦磷酸測序技術(shù)。該方法對于操作技術(shù)要求較高,且受較多因素影響。值得一提的是焦磷酸測序技術(shù),研究顯示：與常規(guī)藥敏方法比較,該法的敏感度為96.7%,特異度為97.3%［17-18］。該技術(shù)是依靠生物發(fā)光進(jìn)行的實(shí)時(shí)DNA測序分析技術(shù),其操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確,且無需電泳和熒光標(biāo)記,同時(shí)能提供精確的堿基序列信息。與Sanger法相比,焦磷酸測序技術(shù)測試速度快、成本低廉。由于該技術(shù)適用于對已知的較短DNA序列的測序分析,所以非常適合Mtb的耐藥性檢測。本法存在的主要問題是：操作繁瑣,條件要求嚴(yán)格,要測的耐藥基因種類很多,無效突變也被檢出,而且需要昂貴的儀器設(shè)備,費(fèi)用較貴。

結(jié)核病耐藥性檢測技術(shù)展望

結(jié)核病耐藥性快速檢測研究雖然已取得了一些進(jìn)展,但仍不能滿足臨床診治的需要。這主要與下述因素有關(guān)：首先是細(xì)菌藥敏檢測方法都是生長依賴性的,即只能對分離的菌株進(jìn)行檢測,因而仍需較長時(shí)間；其次是藥敏結(jié)果的臨床含義即細(xì)菌學(xué)耐藥與臨床耐藥結(jié)果的一致性不確切；再者由于方法、原理及藥物濃度上的差異,各方法間缺乏良好的可比性。另外快速測定大多需特殊的儀器設(shè)備,且費(fèi)用較貴,難以普及應(yīng)用。再者分子生物學(xué)檢測方法在國內(nèi)尚屬研究階段,許多問題還沒得到解決,因此短期內(nèi)難以用于臨床。

一、當(dāng)前結(jié)核病耐藥性檢測存在的主要問題

1.缺乏系統(tǒng)的方法學(xué)評價(jià)：雖然,目前報(bào)道的 Mtb耐藥檢測方法眾多,但能通過系統(tǒng)、科學(xué)的方法學(xué)評價(jià)的方法、且真正可用于臨床的方法仍然很少。

2.方法學(xué)之間的比較研究缺乏：各種方法學(xué)的符合度及綜合比較情況不清。

3.檢測藥物種類不全面：大多數(shù)耐藥性分子生物學(xué)檢測方法僅針對利福平和異煙肼少數(shù)藥物。

4.操作規(guī)范化和質(zhì)量控制不夠：操作人員缺乏規(guī)范化培訓(xùn),水平參差不齊,實(shí)驗(yàn)場地、儀器設(shè)備相距離很大,質(zhì)量控制體系不健全。

5.與耐藥相關(guān)的基礎(chǔ)研究不夠深入：目前仍有許多藥物的耐藥機(jī)制不清,導(dǎo)致無法進(jìn)行分子藥敏檢測。

6.缺乏耐藥檢測新技術(shù)的轉(zhuǎn)化：導(dǎo)致基礎(chǔ)研究成果不能及時(shí)進(jìn)入臨床應(yīng)用。

二、當(dāng)前耐藥性測定亟待解決的問題

首先：科學(xué)評估已有測定技術(shù),要做到科學(xué)、客觀、公平、公正,篩選出適合我國國情的耐藥性測定新技術(shù),進(jìn)而推廣應(yīng)用。

第二：要加強(qiáng)現(xiàn)有藥物的抗結(jié)核作用篩查,尤其是進(jìn)行廣譜抗生素的抗結(jié)核作用篩查,以便為抗結(jié)核治療提供依據(jù)。

第三：加強(qiáng)檢驗(yàn)技能培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)場地建設(shè)。

第四：加強(qiáng)檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量控制工作,健全質(zhì)控體系。

第五：研究新的耐藥性測定技術(shù),包括細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)藥敏檢測技術(shù),尤其是要開展RNA分子藥敏檢測技術(shù)研究,開展耐藥相關(guān)的新型分子靶標(biāo)篩查,開展耐藥相關(guān)差異蛋白檢測,開展耐多藥相關(guān)的酶學(xué)檢測技術(shù)研究。

第六：促進(jìn)已有研究成果的轉(zhuǎn)化,將研究成功的檢測新技術(shù)盡快試用于臨床。

第七：加強(qiáng)抗結(jié)核新藥的研究,包括西藥、中藥、化學(xué)合成藥物等。

近年來,盡管耐多藥結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷取得了一些進(jìn)展,但是還存在許多問題應(yīng)予重視。需要從事結(jié)核病基礎(chǔ)、臨床和防控人員緊密協(xié)作,聯(lián)手對存在的問題進(jìn)行攻關(guān)。相信隨著檢測方法的先進(jìn)性、試劑的標(biāo)準(zhǔn)化和操作的規(guī)范化,以及臨床意義界定等問題的逐步解決,結(jié)核病耐藥性的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)必將取得更大進(jìn)展！

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The progress and the existing problems and countermeasures of TB drug resistance testing technolog

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HU Zhong-yi. Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis,Shanghai Pulmonary Hospital,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200433,China

HU Zhong-yi,Email：shtblab@163.com

TB drug resistance testing technology research has made significant progress,but still cannot meet the needs of clinical diagnosis and treatment,and prevention and control.Some new drug susceptibility testing technology including molecular biology and bacteriology is more rapid and sensitive than the traditional detection method,but all kinds of new tools have some problems in clinical application.In this review,the advantages and disadvantages of these new technologies are presented and the potential countermeasures and the advancements are put forward,so as to improve the promotion and application of the new technologies.

Tuberculosis； Drug resistance,bacterial； Microbial sensitivity tests

2013-09-05）

（本文編輯：薛愛華）

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)（2013ZX10003001）,上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（12DZ2271100）

200433上海,同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

胡忠義,Email：shtblab@163.com