甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的毒性效應(yīng)

李學(xué)峰,周啟星,羅 義

(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津 300071)

苯系物(BTEX)是苯(benzene)、甲苯(toluene)、乙苯(ethylbenzen)和二甲苯的 3種同分異構(gòu)體(o-,m-,p-xylene)的統(tǒng)稱.BTEX 是揮發(fā)性單芳香烴,是石油及其副產(chǎn)品汽油、柴油燃料的主要組成成分,并作為殺蟲、塑料和合成纖維的原材料廣泛使用[1-2]. BTEX具有較高的水溶性和毒性,容易被水生生物吸收,易于從溢出或泄漏的儲油罐進入地下水和飲用水,對生態(tài)系統(tǒng)、水生生物和人類健康造成威脅[3].近年來,關(guān)于苯的水生態(tài)毒性有較多報道,而甲苯、乙苯、二甲苯的水生態(tài)毒性相對較少. Holcombe等[4]研究了二甲苯對鰷魚、虹鱒魚、藍腮魚、金魚、水蚤和蝸牛的急性毒性;Niederlehner等[5]研究了甲苯、乙苯和二甲苯對角突網(wǎng)紋蚤的急性和慢性毒性;Masten等[6]研究了乙苯對于三種水生生物大西洋銀河魚、塘蝦、硅藻和水藻的急性毒性.然而國內(nèi)僅有范亞維等[7-8]研究了這3種污染物對斑馬魚、大型溞和霍普水絲蚓的急性毒性,缺少對不同種類水生生物的毒理研究,及對底棲生物毒性的探討.在實際水生生態(tài)系統(tǒng)中,通常存在多種污染物,它們彼此影響,產(chǎn)生拮抗,相加或協(xié)同作用,聯(lián)合毒性的研究對于客觀評價污染物的危害性以及環(huán)境標準制定更具實際意義,而甲苯、乙苯和二甲苯的聯(lián)合毒性效應(yīng)國內(nèi)尚未見報道.

中華新米蝦(Neocaridina denticulata sinensis)屬甲殼綱、十足目、匙指蝦科、米蝦屬,是一種小型經(jīng)濟蝦,可食用或作餌料,廣泛分布于我國稻田、池塘、溪流及湖泊等淡水水域;同時,具有生活力強、繁殖快等特點.

因此,本研究以中華新米蝦為受試生物,以甲苯、乙苯和二甲苯(TEX)為目標化合物,基于等毒性溶液法、毒性單位法和混合毒性指數(shù)法研究了TEX污染物對水生動物的聯(lián)合毒性效應(yīng),為今后3種化合物的水質(zhì)基準或標準的制定、污染控制和安全風險評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 受試污染物及其溶液的配制

試驗藥劑:甲苯、乙苯、二甲苯和二甲基亞砜購于天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠,吐溫80購于Sigma(美國),均為分析純.

母液配制:試驗使用助溶劑二甲基二砜和乳化劑吐溫 80配制母液.母液每次試驗前配得,不保存,其中助溶劑和乳化劑不超過100μL/L[9].

1.2 受試生物

試驗生物中華新米蝦購于無錫市南禪寺花鳥魚蟲市場,體長 1.2～1.5cm,體重 0.06～0.08g/只,置于魚缸中,以普通粉末狀魚食喂食,溫度保持在(23±1)℃左右,每 d喂食并換水 1次,所換水為曝氣24h以上自來水,試驗前24h停止喂食,馴化兩周,馴化期間中華新米蝦沒有出現(xiàn)死亡.實驗選用中華新米蝦行動活潑,反應(yīng)靈敏,外觀正常,個體均勻.

1.3 實驗儀器與條件

主要儀器:曝氣裝置,溫度計,恒溫儀,電子分析天平,人工氣候培養(yǎng)箱(SPX-300I-C);pH計(Sartorius ,PB-10);溶解氧測定儀(HACH,HQ-10).

試驗條件:實驗在 1L的大燒杯中進行,試驗溶液體積為1L,每個燒杯放入10只中華新米蝦.實驗周期為 96h,期間不喂食.試驗方式為半靜態(tài),12h換1次水;試驗用水為曝氣48h以上的自來水,溶解氧(DO) 6.4mg/L(飽和度≥60%);pH 值為 7.0左右;溫度為(23±1)℃;光照周期為 16:8(day: night).

1.4 聯(lián)合毒性實驗設(shè)計

在進行中華新米蝦聯(lián)合毒性之前,分別測試其單一毒性.首先進行預(yù)實驗,分別得到 TEX 對中華新米蝦全部存活和全部死亡的濃度范圍,設(shè)定6個濃度,每個濃度做3個平行,同時做空白對照和最高溶劑對照.根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,甲苯的正式試驗濃度分別 6.8,9.1,12.3,16.6,22.4,30mg/L;乙苯和二甲苯的正式試驗濃度均為 6.3,7.9,10.0,12.6,15.8,20mg/L.

在上述單一毒性試驗的基礎(chǔ)上,運用等毒性溶液法(ETS)對 TEX所組成的二元混合物的聯(lián)合毒性進行評價.為了便于計算和試驗結(jié)果的比較,張毓琪等[10]提出,在進行混合物的生物監(jiān)測時,一般可采用毒性單位(Toxic Unit, TU)這一概念.

將單一苯系物對中華新米蝦 96h-LC50值記為 1個毒性強度單位.每個二元混合物(甲苯-乙苯、乙苯-二甲苯和甲苯-二甲苯)按照毒性單位比例的不同,分為4個試驗組(4:1;3:2;2:3;1:4).

運用毒性單位法(TU)和混合毒性指數(shù)法(MTI)對 TEX所組成的三元混合物的聯(lián)合毒性進行評價.根據(jù)修瑞琴等[11]提出按單一毒性最終LC50值進行毒性單位1:1:1或濃度1:1:1的聯(lián)合毒性實驗是較為簡便的.所以,本實驗按照毒性單位1:1:1和濃度1:1:1分為2個試驗組.利用常用等對數(shù)梯度1,1.8,3.2,5.6和10設(shè)置實驗梯度,即按照毒性單位1:1:1設(shè)置5個濃度組的總毒性單位(Total TU)分別為1,1.8,3.2,5.6和10;按照濃度1:1:1設(shè)置 5個濃度組的總濃度為 10,18,32,56,100mg/L.每個實驗組,3個平行,同時設(shè)計空白對照組和最高溶劑對照(100μL/L).記錄 48h和96h各濃度組中華新米蝦的死亡數(shù),并及時撈出死蝦.

1.5 聯(lián)合毒性分析方法

圖1 等毒性溶液法示意Fig.1 Curve for the explanation of equal toxicity solution method when examining the joint toxic action between two chemicals

等毒性溶液法(ETS)是一類經(jīng)典的經(jīng)驗主義方法,具有簡單、快速、可視化的優(yōu)點,常常用來研究二元混合物的聯(lián)合毒性作用[12].試驗結(jié)束后,計算按不同毒性單位混合的各試驗組的平均死亡率及標準差,并將所得數(shù)據(jù)以不同混合比為橫坐標,致死率為縱坐標作折線圖.如圖1所示,如果所做的毒性效應(yīng)曲線在兩種物質(zhì)半數(shù)致死率連線的上方,則為協(xié)同作用;若毒性效應(yīng)曲線在聯(lián)線的下方,則為拮抗作用;在連線上下波動的是相加作用.

由 Sprague等[13]首先提出,Marking等[14]將這一概念推廣到評價混合物的聯(lián)合毒性.通過分別計算相加指數(shù)M和M0去確定特定二元混合物的聯(lián)合作用類型[15-16].根據(jù)毒性單位法對試驗結(jié)果進行評價,公式如下:

式中:TUi為混合物中i的毒性單位;max(TUi)為混合物中各組分毒性單位最大值;M為混合物中各組分的毒性單位之和.當M=1時,聯(lián)合效應(yīng)為簡單相加作用;當1 M0為拮抗作用.

混合毒性指數(shù)法(MTI)是由 K?nemann[17]首次提出,評價多元混合物對魚的聯(lián)合毒作用的方法.MTI的定義為:

評價標準為:當 MTI=1時,為簡單相加作用;當MTI<0時,為拮抗作用;當MTI>1時,為協(xié)同作用;當 MTI=0 時,為獨立作用;當 0

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件實驗所得數(shù)據(jù)進行分析,所有試驗數(shù)據(jù)均以 3個平行組數(shù)據(jù)的平均值±標準差(Means±SD)來表示.采用單位概率法(Probit Analysis)進行回歸分析求得半致死濃度LC50值,采用單樣本K-S Test檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性質(zhì),采用單樣本T檢驗(One-SimpleTTest)對對照組與實驗組進行差異顯著性分析,P**<0.05表明差異顯著,P*<0.01表明差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 TEX對中華新米蝦的單一毒性

圖2 TEX對中華新米蝦的48h和96h單一毒性效應(yīng)Fig.2 The curves for single toxic effects of TEX on Neocaridina denticulata sinensis after a 48h or 96h exposure

在試驗期間,空白和溶劑對照組均未出現(xiàn)中華新米蝦的死亡或異?，F(xiàn)象.當甲苯,乙苯,二甲苯濃度超過5mg/L時,中華新米蝦開始呈現(xiàn)明顯的中毒癥狀,身體失去平衡,快速無序游動,非常不安,隨后在水面出現(xiàn)側(cè)翻,腮部出現(xiàn)明顯充血癥狀.當甲苯濃度達 30mg/L,暴露時間達 30h,乙苯和二甲苯濃度達20mg/L,暴露時間20h時,中華新米蝦全部死亡.由圖2所示,隨著BTEX濃度的增加及暴露時間的延長,中華新米蝦的死亡率逐漸升高.

表1 TEX對中華新米蝦單一毒性數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析Table 1 Statistical analysis of single toxicity data of TEX on Neocaridina denticulata sinensis

表2 中華新米蝦的LC50對TEX的回歸關(guān)系Table 2 Regression relationships between the mortality of Neocaridina denticulata sinensis and the concentration of TEX

2.2 TEX二元混合物對中華新米蝦的聯(lián)合毒性

由圖 3可見,甲苯和乙苯按不同毒性單位比(均為1個毒性單位)混合96h對中華新米蝦的致死率為 43.3%～56.7%,與甲苯或乙苯單獨作用時毒性效果相近,且所做的毒性效應(yīng)曲線在 1個毒性單位甲苯溶液與 1個毒性單位乙苯溶液致死率連線上下波動.因此,甲苯與乙苯所組成的二元混合物的聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用.

圖3 甲苯-乙苯二元混合物對中華新米蝦聯(lián)合毒性Fig.3 The curve for joint toxicity of binary mixtures of toluene and ethylbenzene on Neocaridina denticulata sinensis

由圖4可見,乙苯和二甲苯同樣按不同毒性單位比(均為1個毒性單位)混合96h對中華新米蝦的致死率為 46.7%～56.7%,與乙苯或二甲苯單獨作用時毒性效果相近,且所做的毒性效應(yīng)曲線在1個毒性單位乙苯溶液與1個毒性單位二甲苯溶液致死率連線上下波動.因此,乙苯與二甲苯所組成的二元混合物的聯(lián)合作用同樣表現(xiàn)為相加作用.

由圖 5可見,甲苯、二甲苯按不同毒性單位比(均為1個毒性單位)混合96h對中華新米蝦的致死率為36.7%～60%,與甲苯或乙苯單獨作用時毒性效果相近,且所做的毒性效應(yīng)曲線在 1個毒性單位甲苯溶液與 1個毒性單位乙苯溶液致死率連線上下波動.因此,甲苯、乙苯所組成的二元混合物的聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用.

圖4 乙苯-二甲苯二元混合物對中華新米蝦聯(lián)合毒性Fig.4 The curve for joint toxicity of binary mixtures of ethylbenzene and xylene on Neocaridina denticulata sinensis

圖5 甲苯-二甲苯二元混合物對中華新米蝦聯(lián)合毒性Fig.5 The curve for joint toxicity of binary mixtures of toluene and xylene on Neocaridina denticulata sinensis

在采用等毒性溶液法(ETS)評價甲苯,乙苯,二甲苯兩兩混合所組成的二元混合物96h聯(lián)合毒性時,所做的毒性效應(yīng)曲線均在兩種物質(zhì)半數(shù)致死率連線上下波動,均表現(xiàn)為相加作用.這表明它們對水生生物的作用機理相近,總的毒性效應(yīng)為各因素單獨作用之和,并無顯著的拮抗或協(xié)同作用.

2.3 TEX三元混合物對中華新米蝦的聯(lián)合毒性

甲苯-乙苯-二甲苯按照毒性單位1:1:1混合,采用毒性單位法(TU)評價聯(lián)合作用效果,當暴露時間為 48h時,M0=2.998>M=1.574>1,故聯(lián)合作用表現(xiàn)為部分相加作用(表 3);當暴露時間為96h,M=0.987 <1,聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用.采用混合毒性指數(shù)法(MTI)評價聯(lián)合作用效果,當暴露時間為48h,0 < MTI = 0.587< 1,聯(lián)合作用表現(xiàn)為部分相加作用;當暴露時間為 96h,MTI =1.013>1,聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用.甲苯-乙苯-二甲苯按照濃度1:1:1混合,采用毒性單位法(TU)評價聯(lián)合作用效果,暴露時間為48h,M0=2.672 >M=1.697>1,聯(lián)合作用表現(xiàn)為部分相加作用;當暴露時間為96h時,M=0.926 <1,聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用.采用混合毒性指數(shù)法(MTI)評價聯(lián)合作用效果,當暴露時間為 48h,01,聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用.

由表 3可知,不論采用的方法是毒性單位法還是混合毒性指數(shù)法,當暴露時間為48h時,聯(lián)合作用方式均表現(xiàn)為部分相加作用,而當暴露時間為96h時,聯(lián)合作用均表現(xiàn)為協(xié)同作用.也就是說,隨著暴露時間的增加,三者聯(lián)合毒性作用從部分相加作用轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘栽黾拥膮f(xié)同作用.

3 討論

3.1 單一毒性

3種苯系污染物對中華新米蝦的單一急性毒性作用大小順序為:乙苯>二甲苯>甲苯,這與范亞維等[7-8]在研究 TEX對水生生物的急性毒性效應(yīng)時所得到的作用結(jié)果非常類似.TEX污染物在毒性作用上的差異很可能與其在分子結(jié)構(gòu)的差異密切相關(guān).TEX都屬于單芳香烴,但苯環(huán)上的取代基的數(shù)量及位置不同,這種分子結(jié)構(gòu)上的差異必然導(dǎo)致一些物理化學(xué)性質(zhì)的不同,從而導(dǎo)致其水生生態(tài)毒性的差異.TEX均屬于非極性麻醉型化合物,而非極性麻醉型化學(xué)物質(zhì)所引起的生物麻醉的能力與其疏水性成正比,主要表現(xiàn)為對生物體細胞膜的穿透性破壞作用[18].因此,非極性麻醉型化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)毒性可以用辛醇-水分配系數(shù)(lgKow)來確定[19].甲苯、乙苯和鄰、間、對位二甲苯20℃辛醇-水分配系數(shù)lgKow分別是2.69、3.15、2.77、3.20和3.15,即3種物質(zhì)疏水性順序為:乙苯>二甲苯(總)>甲苯,驗證了本文的實驗結(jié)果.

3.2 聯(lián)合毒性

聯(lián)合毒性作用已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注,相關(guān)理論也日益成熟.如今,當預(yù)測化學(xué)物質(zhì)的聯(lián)合作用時,通常認為作用方式(Mode of Action)服從兩種基本模型,分別為 a)濃度相加(concentration addition, CA),指化學(xué)物質(zhì)遵循以相同方式作用于受體. Poch[20]以嚴格的作用機制角度,認為這個模型僅僅適用于那些擁有相同分子結(jié)合部位的化合物.Berenbaum[21]以廣義現(xiàn)象學(xué)的角度,認為不同化學(xué)物質(zhì)只要對生物的毒性響應(yīng)值相似,即可認為符合濃度相加模型.但是,實際上,濃度相加模型已經(jīng)被視為是一種通用模型去預(yù)測混合物的聯(lián)合作用,尤其在缺乏研究物質(zhì)作用機制參考資料的條件下.b)獨立作用(independent action, IA),指化學(xué)物質(zhì)不以相同方式作用于受體. 雖然獨立作用被認為在毒理學(xué)理論研究中意義重大,但是很多科學(xué)家懷疑它的實際應(yīng)用,特別是在整個生物體和種群水平,還有水污染控制研究方面.目前,這兩種參考模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理評價中,并收到了良好的效果[22-24].

表3 甲苯-乙苯-二甲苯三元混合物按毒性單位1:1:1和濃度1:1:1混合對中華新米蝦的聯(lián)合毒性Table 3 Joint toxicity of ternary mixtures of toluene, ethylbenzene and xylene on Neocaridina denticulata sinensis after a 48h or 96h exposure in toxic unit ratio 1:1:1 and concentration ratio 1:1:1

TEX具有極其相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)與物理化學(xué)性質(zhì),基于文獻和上述毒性試驗所得到的毒理數(shù)據(jù),可以看出 3種物質(zhì)對于不同水生生物的毒性強度也非常相似,均在一個數(shù)量級上.所以,理論上很容易理解 TEX應(yīng)當具有相同的作用方式,進一步假設(shè)認為,TEX應(yīng)當遵循濃度相加模型.因此,本文假設(shè)TEX的聯(lián)合作用方式符合濃度相加模型.

本論文基于等毒性溶液法研究了TEX二元混合物對中華新米蝦的聯(lián)合毒性,其聯(lián)合作用結(jié)果表現(xiàn)為相加作用.在采用毒性單位法和混合毒性指數(shù)法評價TEX三者混合所組成的三元混合物48h和96h的聯(lián)合毒性時,聯(lián)合毒性效應(yīng)均表現(xiàn)為:隨著暴露時間的推移,由部分相加轉(zhuǎn)化為協(xié)同作用.這說明聯(lián)合作用的類型,會隨著暴露時間的延長隨之發(fā)生變化[25-28].然而,即使96h聯(lián)合作用均表現(xiàn)為協(xié)同作用,但是協(xié)同作用的傾向不顯著,如M=0.987,0.926,MTI=1.013,1.077均非常接近于 1,這表明聯(lián)合作用接近于相加作用.由于實驗誤差的存在,M=1是個理想狀態(tài),實驗室很難得到.所以,Broderius等[29]認為只要實驗組的總TU=1±0.2,就可將其作用結(jié)果視為相加作用.由表 4.2 可知,M值為 0.925～1.231,接近于 1 且在1±0.2范圍內(nèi),因此可理解為相加作用.因此, TEX三元混合物的聯(lián)合作用主要表現(xiàn)為相加作用.綜上,TEX污染物對中華新米蝦的聯(lián)合作用類型符合相加作用.

TEX是三種簡單的單芳香烴,結(jié)構(gòu)非常相似.因此,它們具有相似的物理化學(xué)性質(zhì),例如分子量、密度、沸點和辛醇水分配系數(shù)等.另外,它們都是麻醉性化學(xué)物質(zhì),它們毒性作用方式同樣是麻醉性的,并且 TEX化合物都作用于生物細胞膜[30-31].而且通過上述水生動物的毒理實驗結(jié)果證實了TEX表現(xiàn)出了相似的毒性作用.所以,CA模型非常合理地預(yù)測了TEX混合物的單一毒性,而且完美的預(yù)測了TEX混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng).

目前,對苯系物的中毒機制研究的還比較少,苯系物對水生生物的毒性數(shù)據(jù)也比較缺乏,而且,苯系物的聯(lián)合作用也是非常復(fù)雜的,受到多種因素的影響,不同評價和模型方法會得出不同的結(jié)論,所以對于苯系物對水生生物的聯(lián)合作用還有待進一步的討論和深入的研究.但是,本論文提供了豐富的甲苯、乙苯和二甲苯對水生生物的單一急性和聯(lián)合毒性的毒理數(shù)據(jù),對于今后修訂苯系物水質(zhì)標準和制定苯系物的水質(zhì)基準有著深遠的意義,而且在把甲苯、乙苯和二甲苯整體作為一個水質(zhì)指標時,可以利用相加作用模型進行分析與評價.

4 結(jié)論

4.1 甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的單一急性毒性試驗中,96h-LC50分別為 13.8,10.4,11.3mg/L,均屬于中等毒性毒物,且毒性大小順序為:乙苯>二甲苯>甲苯.

4.2 基于等毒性溶液法,甲苯、乙苯和二甲苯的二元混合物的聯(lián)合毒性作用結(jié)果為相加作用.

4.3 基于毒性單位法和混合毒性指數(shù)法,甲苯、乙苯和二甲苯的三元混合物的聯(lián)合毒性作用結(jié)果表現(xiàn)48h部分相加作用,96h協(xié)同作用,但作用并不明顯,可以近似認為是相加作用.

4.4 驗證了甲苯、乙苯和二甲苯的聯(lián)合作用符合濃度相加(CA)模型,并進一步驗證了具有相同作用方式(MoA)的化學(xué)物質(zhì)的聯(lián)合作用很可能同樣符合濃度相加(CA)模型.

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