蛋白激酶PRKX對人肝癌細(xì)胞粘附和遷移能力的影響

胡啟凱 任 斌

（山西中醫(yī)學(xué)院體育部，太原030024）

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，病死率高［1］。手術(shù)治療是目前肝癌最有效的治療方法，但即使是根治術(shù)后5年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60－70%。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的最主要因素，因此抗肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，減少術(shù)后復(fù)發(fā)成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［2－3］。PRKX是一種cAMP依賴的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，蛋白激酶PRKX與上皮細(xì)胞遷移與分支浸潤有關(guān)［4］，提示其可能在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮作用。目前，對PRKX在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對肝癌細(xì)胞粘附和遷移能力的影響還沒有研究報道。本研究通過在SMMC－7721細(xì)胞中過表達(dá)PRKX，研究PRKX對人肝癌細(xì)胞粘附和遷移的影響和作用。

材料和方法

1．材料

人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721購于中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液 （Invitrogen）， 胎 牛 血 清 （Invitrogen），pDONR223－PRKX（Addgene），Lipofectamine 2000（Invitrogen），BCA 蛋 白 定 量 試 劑 盒 （Pierce），PRKX抗體（Abcam），β－actin抗體（Sigma），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG（Cell Signaling Technology），PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色試劑盒（Millipore），蛋白裂解液及其他 Western blot試劑（碧云天），CellTiter 96AQueous One Solution Reagent（Promega），Calcein－AM （BD），Matrigel（BD），F(xiàn)luoroBlok細(xì)胞培養(yǎng)池（BD Falcon）。

2．方法

2．1細(xì)胞培養(yǎng)：

SMMC－7721細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U／mL、pH7．3的 RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，約3天傳代1次。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至豐度為80%時，用0．25%胰酶消化，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞間隙增大、觸角回縮時終止消化，分瓶培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)期生長時開始實(shí)驗(yàn)。

2．2轉(zhuǎn)染及蛋白印跡鑒定：

將SMMC－7721細(xì)胞接種到6孔板中，參照說明書采用脂質(zhì)體法將pDONR223－PRKX轉(zhuǎn)染至SMMC－7721細(xì)胞。72h后，收集對照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，PBS漂洗2次，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲裂解，高速離心后取上清液冷凍保存，抽提好的蛋白，用BCA試劑盒以570nm于Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀上測定蛋白含量。制備10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）進(jìn)行電泳，每孔加入50μg的變性蛋白質(zhì)。電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h后，加入小鼠抗人PRKX抗體，4℃過夜孵育。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h。洗滌后采用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色試劑盒反應(yīng)，X膠片顯色，暗室，曝光。掃描膠片，用ImageJ軟件（National Institutes of Health，NIH）對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以βactin蛋白的表達(dá)作為參照。

2．3粘附實(shí)驗(yàn)：

細(xì)胞基質(zhì)－粘附實(shí)驗(yàn)采用的Matrigel膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)，其主要成分包括層黏連蛋白、膠原IV等，同時含轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF－β）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）以及其它在EHS腫瘤中自然表達(dá)的生長因子。室溫下Matrigel可自動聚集產(chǎn)生類似于哺乳動物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料。具體步驟如下：將 Matrigel（5μg／孔）包被于96孔板，37℃孵育24h，加入1%BSA RPMI l640（50μL／孔），37℃孵育1h，PBS洗3次。消化對照組和轉(zhuǎn)染組SMMC－7721細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以1×105／孔接種于96孔板中，37℃孵育1h。PBS輕洗3次，每孔加20μl CellTiter 96AQueous One Solution Reagent，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1．5h，置 Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀上選擇490nm波長讀取吸光度值（OD 490）。每組設(shè)6個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2．4遷移實(shí)驗(yàn)：

Boyden小室試驗(yàn)是檢查腫瘤遷移、侵襲能力的主要方法之一。本實(shí)驗(yàn)中利用不同血清濃度建立的梯度因素，誘發(fā)肝癌細(xì)胞向下遷移通過濾膜。具體步驟如下：消化對照組和轉(zhuǎn)染組SMMC－7721細(xì)胞，計(jì)數(shù)后熒光染料Calcein－AM標(biāo)記細(xì)胞，細(xì)胞種植在含1% 胎牛血清的RPMI l640培養(yǎng)液的FluoroBlok細(xì)胞培養(yǎng)池。4h后，將FluoroBlok細(xì)胞培養(yǎng)池轉(zhuǎn)移至含5%胎牛血清的RPMI l640培養(yǎng)液的24孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12h，置Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀上進(jìn)行熒光定量檢測，以不同組測得的相應(yīng)的熒光數(shù)值進(jìn)行比較。每組設(shè)6個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5和StatView 5．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，差異顯著性水平取P＜0．05，差異非常顯著性水平取P＜0．01。

結(jié) 果

1．肝癌細(xì)胞系中PRKX蛋白的表達(dá)

蛋白印跡測定結(jié)果顯示，SMMC－7721細(xì)胞PRKX轉(zhuǎn)染組PRKX蛋白的表達(dá)較對照組明顯增加（圖1）。這為研究高表達(dá)的PRKX在肝癌細(xì)胞系中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 PRKX在肝癌細(xì)胞SMMC－7721中的表達(dá)Fig．1The expression of PRKX protein in SMMC－7721 cells C：對照組；T：PRKX轉(zhuǎn)染組

2．PRKX對肝癌細(xì)胞粘附的影響

為了檢測PRKX對肝癌細(xì)胞粘附能力的影響，對照組和轉(zhuǎn)染組SMMC－7721細(xì)胞種植在Matrigel包被的板內(nèi)。采用修改的MTS方法，MTS（一種四唑類化合物）被活細(xì)胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中，通過顏色反應(yīng)檢測兩組細(xì)胞對Matrigel的粘附效果。結(jié)果顯示，SMMC－7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染組的粘附能力較對照組明顯增加（P＜0．05，圖2）。

圖2 PRKX對肝癌細(xì)胞SMMC－7721粘附的影響Fig．2The effect of PRKX on the adhesion of SMMC－7721cells＊＊P＜0．01，n＝3．

3．PRKX對肝癌細(xì)胞遷移的影響

采用修改的“Boyden小室試驗(yàn)”，通過檢測穿過FluoroBlok細(xì)胞培養(yǎng)池的標(biāo)記細(xì)胞的熒光值，分析PRKX對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示SMMC－7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染組的遷移能力較對照組明顯增加（P＜0．05，圖3）

圖3 PRKX對肝癌細(xì)胞SMMC－7721遷移的影響Fig．3The effect of PRKX on the migration of SMMC－7721 cells．AFU：arbitraryfluorescence units．＊P＜0．05，n＝3．

討 論

惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制，目前尚未十分明了，但已知是一個由一系列步驟組成的復(fù)雜過程，包括腫瘤細(xì)胞彼此之間的粘附力減少；癌細(xì)胞附著于細(xì)胞外基質(zhì)成分基底膜；細(xì)胞外基質(zhì)的降解；癌細(xì)胞的移出等［2，5］。探討腫瘤細(xì)胞粘附和遷移的調(diào)控機(jī)制對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究和臨床干預(yù)治療具有重要的意義。目前已有對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因素的干預(yù)方面的研究。比如，大劑量長療程應(yīng)用α干擾素（IFN－α）治療能夠抑制肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長，其抑制術(shù)后復(fù)發(fā)的作用較抑制未經(jīng)切除的移植瘤的作用更為明顯，并且其效應(yīng)是劑量依賴性，作用機(jī)理可能為阻斷肝癌的腫瘤血管形成［6］。

蛋白激酶是細(xì)胞活化包括腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要信號分子，也是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞粘附、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素［7－8］。1995年研究克隆發(fā)現(xiàn)了人蛋白激酶PRKX，與經(jīng)典的蛋白激酶A、B、C等不同，是一種新的蛋白激酶，其催化活性比蛋白激酶A（PKA）弱［9－11］。本 研 究 首 先 對 PRKX 在 肝 癌 細(xì) 胞 系SMMC－7721中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRKX蛋白在SMMC－7721肝癌細(xì)胞有表達(dá)。人們最先在腎臟發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)PRKX具有某些重要的生物學(xué)功能［11］。之后有學(xué)者對PRKX在小鼠胚胎和成后年在不同器官組織的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PRKX在大腦、腎臟、肝組織中的表達(dá)隨發(fā)育的不同階段表達(dá)不同，在胚胎的表達(dá)較豐富，成年后表達(dá)降低［12］。粘附是腫瘤細(xì)胞侵襲的第一步，是調(diào)節(jié)某些腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要步驟，這種行為可能會影響轉(zhuǎn)移過程中的幾個階段［13］。本實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)PRKX后，SMMC－7721肝癌細(xì)胞對基質(zhì)膠的粘附能力顯著增加，提示PRKX可能對肝癌細(xì)胞的粘附能力具有促進(jìn)作用。

研究中過表達(dá)PRKX后，肝癌細(xì)胞SMMC－7721的遷移能力顯著增加。與采用固定、染色、顯微鏡下人工計(jì)數(shù)穿過細(xì)胞數(shù)的方法不同［14，15］，在本實(shí)驗(yàn)中通過熒光染料預(yù)先標(biāo)記待測細(xì)胞，檢測時通過測量標(biāo)記細(xì)胞的熒光表達(dá)量來進(jìn)行定量比較。有研究報道，體外過表達(dá)PRKX可以激活腎臟上皮細(xì)胞系FIB4細(xì)胞的遷移；促進(jìn)MDCK細(xì)胞系上皮樣細(xì)胞分支形態(tài)的形成［11］。已有證據(jù)表明，蛋白激酶家族中蛋白激酶B（PKB／Akt）、蛋白激酶C（PKC）等在肝癌細(xì)胞的增殖、浸潤、遷移中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［16，17］。采用反義寡核苷酸技術(shù)降低PKC－α的表達(dá)，可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［16］。值得注意的是，前面提到的PRKX在腎臟上皮細(xì)胞的作用研究中，PKA沒有發(fā)揮相似的激活促進(jìn)作用［11］。以上結(jié)果和文獻(xiàn)證據(jù)提示，PRKX可能通過某些不同于PKA的生物學(xué)功能發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。PRKX促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。有研究表明，PRKX可以通過激活CREB依賴的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)揮其活性［18］。推測本研究顯示的PRKX對促進(jìn)肝癌細(xì)胞粘附和遷移能力的作用可能與某些轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)有關(guān)，尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，我們的研究表明，蛋白激酶PRKX與肝癌細(xì)胞的粘附和遷移活動密切相關(guān)，是一個潛在的肝癌治療的新的藥物靶點(diǎn)。在后續(xù)的工作中，我們將對與此有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進(jìn)行深入的探討。弄清這些問題，將有利于進(jìn)一步認(rèn)識肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為肝癌的治療提供新的思路。

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