人EGFR顯性負(fù)性突變體抑制胃癌細(xì)胞促血管形成能力

廖 剛 王子衛(wèi)＊ 張 能 董浦江 湯為學(xué)

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶400016；2云南省第一人民醫(yī)院普通外科，昆明650032；3重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心；4重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，重慶400016）

人表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）屬于酪氨酸蛋白激酶型受體，由三部份構(gòu)成，分別為胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)，其配體或者其他的酪氨酸激酶受體通過(guò)與其結(jié)合形成二聚體，激活包含在胞內(nèi)區(qū)內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)，活化一系列信號(hào)通路下游基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著不可替代的作用［1］。人EGFR顯性負(fù)性突變體（Dominant negative EGFR，DNEGFR）缺 失 EGFR 的胞內(nèi)區(qū)，有阻斷EGFR信號(hào)通路的功能。血管形成是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的基本條件［2］，一般的實(shí)體腫瘤細(xì)胞均具備有促血管形成能力。因而，抑制腫瘤血管形成是近年來(lái)腫瘤生物治療的重要研究方向。胃癌屬于實(shí)體瘤，當(dāng)然也不例外。DNEGFR是否能夠抑制人胃癌細(xì)胞促血管形成能力？以及具體分子機(jī)制是什么？目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

材料和方法

1．材料

1．1細(xì)胞及裸鼠

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH／3T3，人胃癌細(xì)胞株SGC－7901及NCI－N87，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。pEGFP－N1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC－7901及NCI－N87細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光 蛋 白 （enhanced green fluorescence protein ，EGFP）；pEGFPN1－DNEGFR 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 轉(zhuǎn) 染 的SGC－7901及 NCI－N87細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá) DNEGFR；均由本文著者前期實(shí)驗(yàn)篩選成功保存［3］。雄性裸鼠在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)。

1．2主要試劑、耗材及儀器

PV－9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑（即用型），濃縮型DAB試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)公司。蘇木素，美國(guó)Sigma－Aldrich公司。RPMI－1640培養(yǎng)基粉末，胰酶，G418，美國(guó)Invitrogen公司。人血管內(nèi)皮 生 長(zhǎng) 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫測(cè)定試劑盒（目錄號(hào)：DVE00），美國(guó)R＆D Systems公司。兔抗小鼠CD34抗體，北京博奧森生物技術(shù)公司。CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio－Rad公司。生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)，上海西域機(jī)電系統(tǒng)公司。石蠟包埋機(jī)及切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司。

2．方法

2．1實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)立如下6組：（1）pEGFPN1－DNEGFR質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC－7901細(xì)胞組（DS組），（2）pEGFPN1－DNEGFR質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 NCI－N87細(xì)胞組（DN 組），（3）pEGFP－N1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 SGC－7901細(xì)胞組 （ES 組），（4）pEGFP－N1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NCI－N87細(xì)胞組（EN 組），（5）SGC－7901細(xì)胞對(duì)照組（即未轉(zhuǎn)染SGC－7901細(xì)胞組，US組），（6）NCIN87細(xì)胞對(duì)照組（即未轉(zhuǎn)染NCI－N87細(xì)胞組，UN組）。

2．2細(xì)胞培養(yǎng)

US及UN組細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清），在5%CO2、37℃條件的CO2孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每天均定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，使用0．25%的胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC－7901細(xì)胞和NCI－N87細(xì)胞分別采用150 μg／ml和250μg／ml G418終濃度的完全培養(yǎng)基進(jìn)行維持培養(yǎng)。

2．3HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)

采用HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外促血管形成能力［4－7］。制備胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基－20℃冰箱凍存?zhèn)溆?，取出凍存?Matrigel Matrix，放置于4℃冰箱待其緩慢融化，用4℃預(yù)冷的RPMI 1640稀釋 Matrigel Matrix（Matrigel Matrix：RPMI 1640＝1∶3）。將24孔板用稀釋的 Matrigel Matrix鋪板（100μl／孔），胰酶消化收獲90－95%匯合的HUVEC細(xì)胞后接種至24孔板（1×105個(gè)細(xì)胞／孔），加入條件培養(yǎng)基（1ml／孔），放入CO2孵箱孵育6h。在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像（×200）。用Image－Pro Plus 6．0軟件測(cè)量形成管腔的總長(zhǎng)度，計(jì)算平均值。

2．4VEGF蛋白檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 （Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢 測(cè) 培 養(yǎng) 液 中 的VEGF蛋白水平［8］。分別消化收獲人胃癌細(xì)胞到離心管中，用不含抗生素的完全培養(yǎng)基調(diào)到5×104個(gè)／ml，加至6孔板中（2ml／孔），放到CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h。收取培養(yǎng)液離心5min（1，000r／min），吸取上清用于ELISA測(cè)定，同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)下的OD值，最后根據(jù)OD值和細(xì)胞數(shù)目計(jì)算蛋白含量。

2．5裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)能力測(cè)定

分別消化收獲每組人胃癌細(xì)胞到離心管中，離心后吸棄培養(yǎng)液，加入適量PBS混勻后離心后吸棄，然后用PBS將細(xì)胞調(diào)至密度5×106個(gè)／ml的細(xì)胞懸液。采用4周齡雄性裸鼠，用1ml注射器吸取細(xì)胞懸液對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下注射（200μl／只，6只／組）。4w后處死，剝離出皮下移植瘤測(cè)量大小，并且固定包埋切片進(jìn)行HE染色和PV二步法免疫組織化學(xué)染色。皮下移植瘤體積（V）V＝ （a×b2）／2，a為腫瘤最長(zhǎng)徑，b為最短徑［9，10］。

2．6MVD檢測(cè)

微血管密度（microvessel density，MVD）采用PV即用型二步法（非生物素）檢測(cè)，具體操作參照試劑說(shuō)明書(shū)。采用微波熱修復(fù)，兔抗小鼠CD34抗體稀釋比例為1∶200。先在光學(xué)顯微鏡的低倍下（×100）觀察并選擇3個(gè)熱點(diǎn)區(qū)（血管密集區(qū)域），然后切換至高倍下（×200）進(jìn)行采圖并計(jì)數(shù)血管數(shù)，平均血管數(shù)即為 MVD［11］。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，均采用單因素方差分析（one－way ANOVA）比較組間差異，如果經(jīng)過(guò)分析有差異再運(yùn)用LSD－t檢驗(yàn)做兩兩比較，所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SPSS 17．0軟件完成，P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．DNEGFR抑制HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成

對(duì)于SGC－7901細(xì)胞，DS組平均每個(gè)視野管腔結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度降低到28．0±0．6μm，與 US組（61．3±0．8μm）及ES組（60．8±1．0μm）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），US組與ES組之間比較則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［7］。對(duì)于NCI－N87細(xì)胞，DN組平均每個(gè)視野管腔結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度降低到50．5±1．9μm，與US組（77．9±2．4μm）和ES組（75．8±2．3μm）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；UN組與EN組之間比較則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1，圖2）。結(jié)果揭示DNEGFR具有抑制HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成的作用。

2．DNEGFR抑制VEGF分泌

對(duì)于SGC－7901細(xì)胞，DS組VEGF濃度降低到487．4±11．2pg／106細(xì)胞，與 US組（871．7±13．0 pg／106細(xì)胞）和ES組（865．3±8．5pg／106細(xì)胞）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），US組與ES組之間相比較則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［7］；對(duì)于 NCI－N87細(xì)胞，DN組VEGF濃度降低到670．9±16．2pg／106細(xì)胞，與 US組（871．7±13．0pg／106細(xì)胞）和ES組（865．3±8．5 pg／106細(xì)胞）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），UN組與EN組之間相比較則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

圖3 VEGF的ELISA結(jié)果。Fig 3ELISA Results of VEGF．Note：＊P＜0．05，compared with US and ES groups；△P＜0．05，compared with UN and EN groups．

3．DNEGFR抑制裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)

接種人胃癌細(xì)胞后，裸鼠皮下成瘤率為100%，死亡率為0。裸鼠飼養(yǎng)4w后處死，剝離出皮下移植瘤（圖4，圖5）。對(duì)于SGC－7901細(xì)胞，DS組皮下移植瘤體積降低到0．38±0．22cm3，與US組（1．07±0．17cm3）和 ES組（1．03±0．11cm3）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），US組與ES組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［7］；對(duì)于 NCI－N87細(xì)胞，DN 組皮下移植瘤體積降低到0．70±0．11cm3，與 UN組（1．32±0．13cm3）和EN組（1．24±0．18cm3）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），UN組與EN組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）。皮下移植瘤測(cè)量后，采用多聚甲醛固定石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下均可見(jiàn)核大深染的腫瘤細(xì)胞，充分證實(shí)為人胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤（圖6）。

4．DNEGFR抑制皮下移植瘤血管形成

以CD34抗體標(biāo)記皮下移植瘤的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。對(duì)于SGC－7901細(xì)胞，DS組平均每個(gè)視野微血管數(shù)目降低到6．8±1．2，與US組（15．3±1．2）和ES組（15．5±1．6）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），US組與ES組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于NCI－N87細(xì)胞，DN組平均每個(gè)視野微血管數(shù)目降低到12．2±1．0，與 UN組（18．7±1．6）及EN組（17．7±2．0）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），UN組與EN組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示DNEGFR能夠抑制細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤血管形成。

討 論

腫瘤細(xì)胞惡性表型主要包括：體外和體內(nèi)促血管形成能力、粘附能力和運(yùn)動(dòng)能力、體外和體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力、體外和體內(nèi)生長(zhǎng)能力等，其中促血管形成能力在腫瘤細(xì)胞的惡性表型中扮演著重要的角色，因此抑制腫瘤細(xì)胞促血管形成成為其治療的一個(gè)新的重要途徑和手段。轉(zhuǎn)染pEGFPN1－DNEGFR的人胃癌細(xì)胞，將會(huì)合成融合蛋白DNEGFR－EGFP，其中EGFP僅起對(duì)DNEGFR進(jìn)行定位的作用，不會(huì)影響到DNEGFR的功能；通過(guò)抑制內(nèi)源性EGFR Ser 1046位點(diǎn)的磷酸化，DNEGFR能夠負(fù)調(diào)控內(nèi)源性 EGFR的功能［13］。我們采用pEGFPN1－DNEGFR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)DNEGFR達(dá)到阻斷人胃癌細(xì)胞EGFR信號(hào)通路的目的，研究其對(duì)人胃癌細(xì)胞促血管形成能力的影響和分子機(jī)制。

在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)DNEGFR有抑制人胃癌細(xì)胞株SGC－7901條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成，由于只采用一株細(xì)胞，不能證明該情況適用于其他表達(dá)EGFR人胃癌細(xì)胞株。人胃癌細(xì)胞株SGC－7901及NCI－N87均表達(dá)EGFR，因此我們?cè)谘芯恐羞M(jìn)一步選用這兩種細(xì)胞株并進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)人胃癌細(xì)胞的體外促血管形成能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，DS組和DN組HUVEC形成管腔結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度減少，表明DNEGFR具有抑制人胃癌細(xì)胞促血管生成能力。VEGF是血管形成所需的關(guān)鍵因子［14－16］，據(jù)此我們推測(cè)DNEGFR通過(guò)下調(diào)人胃癌細(xì)胞VEGF的分泌來(lái)抑制血管形成。因此為了明確具體分子機(jī)制，我們采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中VEGF的含量。結(jié)果提示DS組及DN組培養(yǎng)液中VEGF含量降低，證實(shí)了我們對(duì)DNEGFR抑制胃癌細(xì)胞促血管形成能力分子機(jī)制的推測(cè)。

然而HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)是體外實(shí)驗(yàn)，僅是間接評(píng)估腫瘤細(xì)胞促血管生成能力的標(biāo)準(zhǔn)，不能完全模擬裸鼠體內(nèi)的環(huán)境，腫瘤切片的MVD才是評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們采用CD34抗體標(biāo)記計(jì)數(shù)裸鼠皮下移植瘤的微血管，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，DS組和DN組MVD降低，與體外HUVEC管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明DNEGFR在體外和裸鼠體內(nèi)均能抑制人胃癌細(xì)胞的促血管形成能力。血管形成是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的基本條件［2］，腫瘤長(zhǎng)大到2－3mm3體積時(shí)，即需要自身的血供來(lái)滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞新陳代謝的需求［17］。DNEGFR抑制人胃癌細(xì)胞促血管形成能力，而血管形成的抑制將導(dǎo)致胃癌血液供應(yīng)的減少，抑制胃癌的生長(zhǎng)；胃癌生長(zhǎng)受抑制又會(huì)導(dǎo)致其減少VEGF分泌，反過(guò)來(lái)抑制血管形成。

另外，除了通過(guò)旁分泌途徑來(lái)促進(jìn)血管形成外，VEGF還能夠通過(guò)自分泌途徑促進(jìn)表達(dá)VEGF受體腫瘤 細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng)［18，19］。 因 此，DNEGFR 還 同 時(shí)通過(guò)VEGF自分泌途徑抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)受到抑制，我們對(duì)裸鼠皮下瘤體積測(cè)定的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)DNEGFR通過(guò)下調(diào)VEGF分泌抑制胃癌細(xì)胞體外和裸鼠體內(nèi)促血管形成能力，最終抑制裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)。這一結(jié)果將為DNEGFR在胃癌生物治療中進(jìn)一步研究打下理論基礎(chǔ)。然而，在腫瘤血管形成中起調(diào)控作用的細(xì)胞因子較多，在本實(shí)驗(yàn)中我們只研究了VEGF。是否還有其他細(xì)胞因子參與DNEGFR對(duì)人胃癌細(xì)胞促血管形成能力抑制作用的調(diào)控呢？另外，我們僅對(duì)培養(yǎng)液中VEGF進(jìn)行檢測(cè)，移植瘤中的VEGF水平是否與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，以及VEGF受體有無(wú)相應(yīng)變化？這有待我們的進(jìn)一步研究來(lái)明確。

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