白藜蘆醇對脂多糖誘導的急性肺損傷的保護作用

陳向軍 馬李杰 侯紹杰謝永宏 金發(fā)光 李志超

2710032 陜西西安，第四軍醫(yī)大學病理和病理生理教研室

3710032 陜西西安，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院材料教研室

陳向軍，馬李杰，侯紹杰，等.白藜蘆醇對脂多糖誘導的急性肺損傷的保護作用［J/CD］.中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(1):20-24.

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸 窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是多種因素導致的炎癥和抗炎反應失衡、多種炎癥因子參與的復雜的病理過程，確切發(fā)病機制不明，缺乏特異有效治療藥物，是其臨床病死率極高的主要原因［1-3］。因此，探討和尋找治療其有效藥物的研究尤為重要。

白藜蘆醇(resveratrol)是非黃酮類的多酚化合物，化學名是(E)-3，5，4＇-三羥基二苯乙烯［(E)-3，5，4＇-trihydorxystilbene］，最初被發(fā)現(xiàn)是作為一種植物抗毒素，現(xiàn)被醫(yī)學界廣泛重視。白藜蘆醇的藥理作用較為廣泛，例如用來治療博來霉素誘導的肺纖維化，抑制腫瘤細胞的生長和肺部炎癥［4-6］。而白藜蘆醇是否可用于防治ALI/ARDS，并且其可能的機制是什么還有待于更進一步的研究。

材料與方法

一、試劑和儀器

脂多糖(LPS O55:B5)，白藜蘆醇(Purity＞98%)購于Sigma(美國)公司。Real-time PCR試劑盒(TaKaRa，日本)，RNA 提取試劑盒(TaKaRa，日本)，ELISA 檢測試劑盒(R＆B Systems，美國)，Realtime PCR儀(Biored icycler iQ，美國)

二、實驗方法

1.模型復制:健康，雄性小白鼠60只，BAL B/c，18～22 g，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，完全隨機化原則分組為:對照組(control)、白藜蘆醇組(resveratrol)、LPS組、白藜蘆醇預防組(resveratrol+LPS)，每組15只。白藜蘆醇組和白藜蘆醇預防組用白藜蘆醇溶液(40 mg/kg)灌胃。用3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉。仰臥位固定于手術臺上，頸部消毒皮膚，分離氣管，用微量注射器將 LPS(5 mg/kg)緩慢滴入氣管內(nèi)。將小鼠正立輕輕搖晃，縫合皮膚。

2.細胞培養(yǎng):NR8383細胞本實驗室凍存，復蘇后在10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的F12培養(yǎng)基中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件:37℃ 5%CO2待細胞生長狀態(tài)良好且完全長滿培養(yǎng)瓶時，用0.25%胰酶進行傳代。再次傳代時進行分組處理。分為對照組(control組)、白藜蘆醇組(resveratrol組)、LPS組、白藜蘆醇預防組(resveratrol+LPS組)。

3.肺組織病理檢測:動物處死取肺組織，將左肺的一葉肺組織迅速放入4%多聚甲醛中4℃固定24 h～48 h，然后用石蠟包埋。制做5 μm厚的切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

4.肺水腫參數(shù)的檢測:實驗結(jié)束時稱量小鼠體重，放血處死動物迅速剝離右肺(n=8)，用吸水紙吸干表面水分和血液，稱量肺濕重，57℃烤箱內(nèi)將肺烘干至質(zhì)量恒重，再稱量。計算得出肺濕干比(W/D)和右肺/體重之比(R/B)。以此來反映肺水腫的程度。

5.肺組織勻漿中TNF-α、IL-6、硫氧還蛋白1蛋白的表達:采用ELISA方法檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-6、硫氧還蛋白1的含量。取肺組織約100 mg，用 0.01 mmol/L PBS(pH 7.4)0.1 ml用勻漿器勻漿后，4℃ 12 000r/min離心20 min，收集上清，按試劑盒說明書要求操作，顯色后酶標儀讀數(shù)。

6.硫氧還蛋白1 mRNA的表達:取肺組織和收集的NR8383細胞放入Trizol，常規(guī)提取總 RNA，紫外風光光度計檢測濃度。取1 μg總RNA用反轉(zhuǎn)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成為cDNA。按Real-time PCR試劑盒要求加入試劑將其放入PRC儀中進行反應。95℃變性2 min，第二步 95℃變性10 s，退火60℃30 s，70℃延伸45 s的循環(huán)，共40次。小鼠肺組織引物序列:Thioredoxin1(Mouse)Sense5’-TGCTACGTGGTGTGGACCTTGC-3’，Antisense:5 ’-ACCGGAGAACTCCCCCACCT-3’NR8383細胞中引物 序 列:Thioredoxin1 (Rat) Sense 5’-CTCAGCCACGTGGTGTGGGC-3’Antisense 5 ’-TGGCGTGCATTTGACTTCACACTC-3’

7.細胞活力檢測:取對數(shù)生長期的NR8383細胞，分別以5×104接種于96孔板，待生長密度達到70%～80%時改換為無血清培養(yǎng)液。分別在白藜蘆醇組和白藜蘆醇預防組先加入白藜蘆醇終濃度10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml，2 h 后再在 LPS 組和白藜蘆醇預防組加入LPS終濃度1 μg/ml。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育結(jié)束后加入MTT，每孔200 μl培養(yǎng)基加入20 μlMTT(5 mg/ml)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，室溫下?lián)u床10 min使結(jié)晶物充分溶解。選擇在490 nm波長用酶標儀測定，記錄每孔的數(shù)值并計算。得出實驗數(shù)據(jù)做柱狀圖。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、白藜蘆醇對肺組織病理的影響

肺組織病理學顯示，對照組和白藜蘆醇組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)沒有滲出，肺泡壁無增厚(圖1A-B)。LPS組顯示肺組織水腫，并有點片狀出血，大量炎細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，伴有肺不張和肺實變(圖1C)。在白藜蘆醇預防組可見肺泡結(jié)構(gòu)趨于正常，炎癥滲出減少，肺不張和肺實變情況較LPS組減輕(圖1D)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色的病理改變

二、白藜蘆醇對肺組織W/D和R/B的影響

與對照組相比，LPS損傷組W/D和R/B顯著增高(P＜0.05)，白藜蘆醇預防組的 W/D和 R/B顯著低于LPS損傷組(P＜0.05)，白藜蘆醇組與對照組沒有明顯差異，說明單獨用白藜蘆醇處理對肺組織無影響，見表1。

表1 白藜蘆醇對肺水腫指標的影響(±s)

表1 白藜蘆醇對肺水腫指標的影響(±s)

aP＜0.05 vs.Control group;bP＜0.05 vs.LPS group.

Group n W/D(mg·mg－1) R/B(mg·g－1)Control 15 4.55 ±0.21 3.25 ±0.19 Resveratrol 15 4.61 ±0.19 3.52 ±0.21 LPS 15 5.06 ±0.33a 4.02 ±0.29a Resveratrol+LPS 15 4.68 ±0.28b 3.60 ±0.23b

三、白藜蘆醇對TNF-α、IL-6的影響

LPS損傷6 h后與對照組相比，TNF-α、IL-6水平顯著增高(P＜0.05)，Resveratrol+LPS組與 LPS組相比 TNF-α、IL-6的產(chǎn)量顯著減少(P＜0.05)，見表2。

表2 肺組織勻漿中TNF-α、IL-6 ELISA檢測結(jié)果(±s)

表2 肺組織勻漿中TNF-α、IL-6 ELISA檢測結(jié)果(±s)

aP＜0.05 vs.Control group;bP＜0.05 vs.LPS group.

Group n TNF-α(pg/ml) IL-6(pg/ml)Control 15 41.75 ±3.11 70.25 ±6.01 Resveratrol 15 49.01 ±7.42 72.55 ±6.93 LPS 15 577.06 ±42.53a 754.03 ±56.34a Resveratrol+LPS 15 366.67 ±30.04b 340.62 ±29.85b

四、白藜蘆醇對細胞活力的影響

用MTT檢測反應白藜蘆醇對細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)LPS組與對照組比較，細胞活力明顯下降(P＜0.05)。Resveratrol 50 μg/ml和 100 μg/ml可以明顯提高LPS處理過的細胞活力(P＜0.05)。對照組與單獨Resveratrol處理組對比，MTT沒有明顯的變化(圖2)。

圖2 NR8383細胞的MTT含量

五、白藜蘆醇對硫氧還蛋白mRNA的影響

采用Real-time PCR方法檢測肺組織和NR8383細胞中的硫氧還蛋白1的含量，結(jié)果顯示LPS組比Control組的硫氧還蛋白1的mRNA含量明顯減少。白藜蘆醇預防組較LPS組的硫氧還蛋白1的mRNA表達明顯增加(P＜0.05)，見表3。

表3 白藜蘆醇對硫氧還蛋白1在肺組織和NR8383細胞中表達的影響(±s)

表3 白藜蘆醇對硫氧還蛋白1在肺組織和NR8383細胞中表達的影響(±s)

注:Control組與LPS比較aP＜0.05;Resveratrol+LPS組與 LPS組比較;bP＜0.05

Group n Lung NR8383 Control 15 1.00 ±0.11 1.00 ±0.12 Resveratrol 15 0.91 ±0.08 0.93 ±0.09 LPS 15 0.52 ±0.09a 0.48 ±0.05a Resveratrol+LPS 15 1.82 ±0.13b 1.93 ±0.27b

五、白藜蘆醇對肺組織勻漿和細胞勻漿中硫氧還蛋白蛋白含量的影響

采用ELISA方法分別檢測檢測肺組織勻漿和NR8383細胞中的硫氧還蛋白1的蛋白含量，結(jié)果顯示LPS組比Control組的硫氧還蛋白1的蛋白含量明顯減少。白藜蘆醇預防組較LPS組的硫氧還蛋白1的蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，見表4。

表4 ELISA檢測Trx1在肺組織和NR8383細胞中蛋白含量(±s)

表4 ELISA檢測Trx1在肺組織和NR8383細胞中蛋白含量(±s)

aP＜0.05 vs.Control group;bP＜0.05 vs.LPS group.

Group n lung(ng/L) NR8383(ng/L)Control 15 55.27 ±3.67 10.25 ±1.12 Resveratrol 15 54.11 ±5.42 9.55 ±0.93 LPS 15 45.91 ±3.87a 5.36 ±0.41a Resveratrol+LPS 15 67.54 ±5.34b 17.62 ±1.35b

討 論

本實驗中，首先觀察到氣管內(nèi)滴注LPS 6 h后肺組織明顯損傷，顯示肺泡壁明顯增厚，肺泡腔狹窄、大量炎性細胞浸潤、肺泡水腫、肺不張，而用白藜蘆醇處理可以明顯減輕LPS導致的肺組織結(jié)構(gòu)的損傷，減輕肺部炎癥和淤血情況。其次白藜蘆醇處理過的LPS組的肺水腫指標也明顯低于LPS損傷組，肺水腫參數(shù)得到改善。這些結(jié)果表明Resveratrol在整體水平減輕了氣管內(nèi)滴注LPS引起的ALI。

ALI/ARDS的發(fā)生機制和過程復雜而廣泛。ALI是多種因素造成的炎癥反應失調(diào)，內(nèi)毒素可以作為主要的致病因素引起ALI［7］。整體水平和細胞水平結(jié)果說明，LPS分別在5 mg/kg和1 μg/ml可以引起促炎細胞因子釋放，導致小鼠急性肺損傷和細胞活力的下降。當核轉(zhuǎn)錄因子受到外源性刺激后活化轉(zhuǎn)向細胞核內(nèi)，并與TNF-α、IL-6等炎癥因子基因啟動子區(qū)的反應元件結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄與表達，使炎癥因子TNF-α、IL-6產(chǎn)生過多，從而導致更嚴重的組織損傷、結(jié)構(gòu)破壞［8］。在我們的實驗中觀察到，白藜蘆醇處理后可明顯減輕肺組織的炎癥，促炎細胞因子TNF-α、IL-6也明顯減少，此外白藜蘆醇還可顯著提高細胞活力。

近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在治療哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病中有較廣泛的應用前景［9］。白藜蘆醇在抗氧化和抗炎的作用機制中均起到至關重要的作用。白藜蘆醇在慢性阻塞性肺疾病中通過抑制p38MAPK信號通路、減少ROS發(fā)揮抗氧化的作用，從而減輕肺部的炎癥反應［8］。在我們的實驗中觀察到:白藜蘆醇處理后使LPS誘導的Thioredoxin1在mRNA和蛋白水平明顯增加。目前也有報道，通過表達Thioredoxin1具有調(diào)節(jié)NF-κB和抗氧化的雙重特性［10］。Thioredoxin1 是thioredoxin家族的一種重要的小分子蛋白，相對分子量為12×103［11］。它可以利用自身的雙硫鍵進行蛋白的氧化和還原，從而發(fā)揮其氧化還原和清除氧化應激產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物的作用［12］。此外，在慢性間歇性低氧小鼠模型內(nèi)重組的Trx1可以有效降低TNF-α 和 HIF-1 的表達［13］。在白藜蘆醇提高Thioredoxin1的同時也降低了TNF-α、IL-6的產(chǎn)量，提示白藜蘆醇的抗炎作用可能與Thioredoxin1有關。

總之，本實驗研究成功復制了LPS氣管內(nèi)滴注構(gòu)建的ALI模型。并證實白藜蘆醇可減輕肺水腫、減少TNF-α、IL-6的含量，在減輕肺部炎癥細胞浸潤的同時可保護肺組織結(jié)構(gòu)完整性。白藜蘆醇增加Trx1的mRNA和蛋白含量可能是其減輕急性肺損傷的機制之一。本研究結(jié)果為治療急性肺損傷開拓了新的思路，同時也為白藜蘆醇的臨床應用奠定了理論基礎。

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