原發(fā)性肝癌患者用血清、血漿標(biāo)本測定循環(huán)VEGF濃度的差別

程洪濤 郭晨陽 黎海亮 肖金成 胡鴻濤 鄭琳 宗登偉 余樸

[摘要] 目的 探索分析循環(huán)中VEGF濃度在血清和血漿中的差別，及其與血小板計數(shù)的關(guān)系。 方法 從20例未曾接受過治療的原發(fā)性肝癌患者分別采取血清和血漿標(biāo)本使用酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF濃度做自身對照比較。同時分析血小板計數(shù)與血清VEGF和血漿VEGF的相關(guān)性。 結(jié)果 血清VEGF濃度顯著高于血漿VEGF（P=0.000，Z=-3.920），血清和血漿VEGF濃度顯著正相關(guān)（R=0.883，P=0.000）。血清、血漿VEGF濃度均與血小板計數(shù)正相關(guān)（R=0.652，P=0.002；R=0.487，P=0.029），血漿VEGF濃度與血小板計數(shù)相關(guān)性較弱。 結(jié)論 由于受外周血血小板計數(shù)的影響較小，血漿VEGF可能更適于監(jiān)測原發(fā)性肝癌患者的血管生成狀態(tài)。

[關(guān)鍵詞] 癌；肝細胞；血管內(nèi)皮生長因子；血清；血漿；酶聯(lián)免疫吸附測定

[中圖分類號] R735.7???[文獻標(biāo)識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2012）21-108-02

Difference between using serum and plasma samples in measuring circulating VEGF concentration of patients with primary liver cancer

CHENG?Hongtao??GUO?Chenyang??LI?Hailiang??XIAO?Jincheng??HU?Hongtao??ZHENG?Lin

ZONG?Dengwei??YU?Pu

Department of Radiology， Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450008，China

[Abstract] Objective To explore and analyze the difference between serum and plasma in the circulating VEGF concentration and its relationship with platelet count. Methods Serum and plasma samples were collected from 20 untreated patients with primary liver cancer and the enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the VEGF concentration for self control comparison. Meanwhile the correlation between the platelet count and the serum VEGF and plasma VEGF was analyzed. Results The serum VEGF concentration was significantly higher than the plasma VEGF concentration（P=0.000， Z=-3.920）， with positive correlation between them （R=0.883，P=0.000）. Both serum and plasma VEGF concentrations were positively correlated to the platelet count（R=0.652，P=0.002；R=0.487，P=0.029）， but the correlation between the serum VEGF concentration and the platelet count was weak. Conclusion Due to the small influence from peripheral blood platelet count， plasma VEGF may be more suitable for the monitoring of angiogenesis state of patients with primary liver cancer.

[Key words] Cancer； Liver cells； Vascular endothelial growth factor； Serum； Plasma； Enzyme-linked immunosorbent assay

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝細胞肝癌的新血管形成過程中具有重要作用，對肝癌患者的預(yù)后有重要影響。多數(shù)血管生成因子是由腫瘤分泌的可擴散的可溶性肽鏈，理論上循環(huán)中的血管生成因子水平能夠反映腫瘤血管生成的總體活性，通過外周血測定VEGF也可以反映出腫瘤血管生成活性[1]。用血清抑或血漿標(biāo)本測定外周血VEGF可能獲得不同的結(jié)果。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法對兩種標(biāo)本測定外周血VEGF進行自身對照研究，初步探索更適于測定外周血VEGF的標(biāo)本類型。

1?資料與方法

1.1?一般資料

2010年11月～2012年6月同時測定血清和血漿VEGF濃度的原發(fā)性肝癌患者20例，其中男14例，女6例，平均年齡為（59.4±10.9）歲。所有患者之前未接受過任何治療，均于清晨空腹時于肘靜脈抽取靜脈血。

1.2?血漿標(biāo)本的制備

血液標(biāo)本3 mL注入含0.057 mL的15%乙二胺四乙酸三鉀（K3EDTA）的消毒抗凝玻璃試管中，標(biāo)本于1 h內(nèi)低溫離心（2 000 r/min、10 min），取上清分裝于無菌干燥EP管中，并于-70℃冰箱保存。實驗前20 min取出平衡至室溫。

1.3?檢測方法

血清和血漿VEGF濃度均采用檢測采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，VEGF檢測試劑購于上海藍基生物公司（進口分裝，靈敏度為1 pg/mL），用EL312e型酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司，美國）于波長450 nm條件下讀取光密度值。所有樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均雙孔檢測。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑使用手冊進行。

1.4?統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，血清、血漿兩種標(biāo)本VEGF檢測結(jié)果作正態(tài)性檢驗，對測試結(jié)果作配對樣本比較的Wilcoxon 符號秩和檢驗，并進行血清、血漿VEGF濃度和血小板計數(shù)的相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

20例HCC患者的血清和血漿VEGF平均濃度分別為（117.30±96.7）pg/mL和（46.4±14.4）pg/mL；中位濃度分別為72.4 pg/mL（44.5～378.4）和44.0 pg/mL（33.3～79.1），血清VEGF濃度檢測值顯著高于血漿VEGF濃度檢測值（P=0.000，Z= -3.920）。血清VEGF濃度與血漿VEGF濃度具有正相關(guān)性（R=0.883，P=0.000），血清和血漿VEGF濃度均與外周血血小板計數(shù)呈正相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為（R=0.652，P=0.002）和（R=0.487，P=0.029），血漿VEGF濃度與血小板計數(shù)的相關(guān)性較弱。

3?討論

目前，血管生成已被認為可能是HCC惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵事件，HCC是一種高度血管化的腫瘤，血管生成在其腫瘤生物學(xué)中扮演著重要角色。腫瘤細胞可以誘導(dǎo)形成新生血管，通過血液為腫瘤提供營養(yǎng)。此過程觸發(fā)了以內(nèi)源性血管生成因子前體高表達和抗血管生成因子前體低表達為特征的“血管生成開關(guān)”。腫瘤細胞和其他基質(zhì)細胞釋放多種血管生成因子前體[2]。在治療前準(zhǔn)確測定肝癌患者血管生成因子的表達水平，對于提供抗血管生成的靶點并提供預(yù)后信息有重要價值。然而，測定腫瘤表達的血管生成因子，尤其是VEGF，需要像腫瘤微血管計數(shù)一樣，依靠外科標(biāo)本或活檢材料才可做到，而且，利用諸如免疫組化染色之類的半定量技術(shù)還存在觀察者相關(guān)的相當(dāng)大的易變性。此外，腫瘤不同部位血管生成活性具有的不均質(zhì)性，也會使精確測定腫瘤組織內(nèi)的血管生成受到限制。由于多數(shù)血管生成因子是由腫瘤分泌的可擴散的可溶性肽鏈，理論上循環(huán)中的血管生成因子水平能夠反映腫瘤血管生成的總體活性。越來越多的證據(jù)顯示[3-4]，血液循環(huán)中的VEGF濃度在HCC的篩查和監(jiān)測中具有潛在價值，血液循環(huán)中的VEGF水平可能是HCC預(yù)后的獨立預(yù)測因子。血清VEGF高水平與腫瘤被膜消失、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生、微靜脈侵襲有顯著關(guān)系，可作為腫瘤預(yù)后和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)[5-7]。外周血取材方便，采用酶聯(lián)免疫吸附法可以簡便的測定外周血VEGF水平。本實驗顯示HCC患者的血清和血漿標(biāo)本均可采用酶聯(lián)免疫吸附法測出VEGF濃度。

本實驗結(jié)果顯示，血清VEGF濃度顯著高于血漿VEGF濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，Z=-3.920），血清VEGF濃度波動較大，而血漿標(biāo)本濃度波動度較小。由于血清標(biāo)本在制備過程中又有體外凝血的作用，以及血小板脫顆粒的影響，血小板本身釋出的VEGF進入標(biāo)本，使得血清VEGF濃度波動較大，而血漿標(biāo)本在抗凝劑作用下，將血小板對VEGF的影響最小化，且不易受到采血到離心的時間間隔的影響。因此，血漿VEGF濃度受血小板影響小，測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定，更能反映出腫瘤的血管生成活性。本研究結(jié)果顯示，血清和血漿VEGF濃度均與血小板計數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，但是與血漿VEGF濃度相比，血清VEGF濃度與血小板計數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)更高，說明血小板計數(shù)對血清和血漿VEGF濃度均有影響，這可能與血小板生理更新有關(guān)，血小板的平均壽命為10 d左右，衰老的血小板被清除時也可能釋放出血小板源性的VEGF，從而對血漿VEGF濃度產(chǎn)生一定的影響。但使用血漿標(biāo)本可以顯著降低血小板對外周血VEGF濃度的影響。因此，與血清標(biāo)本相比，用血漿標(biāo)本測定外周血VEGF濃度能有有效降低血小板的影響，更能反映出腫瘤血管生成活性。用血漿標(biāo)本測定VEGF，來研究其對HCC患者預(yù)后的影響正逐漸得到認可[3-4，8-9]。

測定外周血VEGF濃度與腫瘤組織VEGF相比具有一定的潛在優(yōu)勢。首先，前者可對所有腫瘤患者進行檢測而不需要外科標(biāo)本或活檢取材；其次，允許在外科切除前進行評價腫瘤的血管生成活性，這有助于確定哪些患者需要新輔助治療或其他治療措施。第三，這是無創(chuàng)的，可以系列性的重復(fù)檢測；第四，與用于腫瘤組織血管生成因子測定的免疫組化染色等半定量檢測技術(shù)相比，定量免疫測定法檢測循環(huán)中的血管生成因子具有更高的精確性。第五，循環(huán)中的血管生成因子檢測費用較低且更加省時。血清VEGF 的水平受標(biāo)本中血小板的量、標(biāo)本處理方式、時間、凝血過程、溫度等因素的影響，限制了其在腫瘤監(jiān)測中的價值。檢測血漿中的VEGF 則可能更加客觀地反映腫瘤組織分泌VEGF 的情況。

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（收稿日期：2012-09-04）