母系遺傳非綜合征型聾相關(guān)線粒體DNA C1494T突變的全國(guó)性調(diào)查△

李琦 袁永一 黃德亮 韓東一 戴樸

隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)在神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss，SNHL)病因?qū)W和診斷中的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mtDNA)突變與非綜合征型聾(nonsyndromic hearing loss，NSHL)的發(fā)病有密切的關(guān)系。1993年，第一個(gè)導(dǎo)致耳聾的mtDNA A1555G突變被發(fā)現(xiàn)[1]。mtDNA A1555G突變是最常見(jiàn)的耳聾相關(guān)線粒體基因突變，發(fā)生率約為1%～3%[2～4]，其他相關(guān)突變?nèi)鏏827G、T961C、T961delT+C(n)ins、T1095C、T7510C、T7511C、G7444A、A7445G等發(fā)生率低、難以見(jiàn)到典型的母系遺傳家系，耳聾人群中和正常人群中的檢出率相差不大。mtDNA C1494T突變作為與藥物性聾關(guān)系密切的突變，2004年由Zhao等[5]首先報(bào)道， 隨后又有散發(fā)的病例報(bào)道[6～10]，但仍未見(jiàn)到在NSHL患者中進(jìn)行大規(guī)模調(diào)查的報(bào)告。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，real-time qPCR)在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)NSHL患者進(jìn)行mtDNA C1494T的篩查，以期為進(jìn)一步研究該突變和聾病的基因診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 收集來(lái)自北京市、河北涿州市和高碑店市、黑龍江牡丹江市、吉林省吉林市、內(nèi)蒙古赤峰市、山西大同市和運(yùn)城市、河南安陽(yáng)市、湖北武漢市、陜西西安市、甘肅蘭州市、寧夏銀川市、青海西寧市、安徽省阜陽(yáng)市、江蘇南通市、上海市、福建福州市、廣東佛山市、廣西柳州市、新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市和庫(kù)爾勒市、云南昆明市和臨滄市、貴州貴陽(yáng)市、四川成都市、西藏拉薩市、遼寧沈陽(yáng)市、山東濱州市等25個(gè)省市的特教學(xué)校和聾啞學(xué)校的3 133例感音神經(jīng)性聾病例為研究對(duì)象，排除綜合征型聾患者、外耳、中耳畸形者、傳導(dǎo)性聾者、智力障礙者。3 133例NSHL患者年齡4～20歲，平均13.82±5.03歲。經(jīng)病史調(diào)查、全身及耳鼻咽喉常規(guī)檢查、純音測(cè)聽(tīng)明確3 133例均為雙側(cè)重度或極重度非綜合征型聾。同胞兄弟姐妹者只選取年齡小者1人納入本項(xiàng)研究，因?yàn)镃14P4T突變?yōu)槟赶颠z傳，同胞兄弟姐妹攜帶相同突變，增加了突變攜帶頻率。

1.2調(diào)查方法 采用問(wèn)卷調(diào)查形式，初篩調(diào)查先期發(fā)放自制式耳聾調(diào)查表,由學(xué)生家長(zhǎng)填寫(xiě)有關(guān)信息，同時(shí)填寫(xiě)知情同意書(shū)，對(duì)回答不明確者通過(guò)電話問(wèn)詢家長(zhǎng)完善相關(guān)信息。調(diào)查表內(nèi)容包括聾兒基本信息、耳聾史、家族史、聾兒出生史、個(gè)人史(聾前傳染病、耳毒性藥物應(yīng)用情況、頭部是否受外傷等)、體檢(全身及專(zhuān)科查體)等。問(wèn)卷調(diào)查及對(duì)參選對(duì)象的遴選(按照有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)納入、排除)等工作均由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員完成。所有耳聾患者均抽取靜脈血3～5 ml，用以提取基因組DNA。

1.3real-time qPCR擴(kuò)增 引物和探針在mtDNA 上的位置是11 933～11 952、12 047～12 076和12 012～12 037。正向引物 5′- GCCCTGAAGCGCGTACAC -3′ ，反向引物 5′- TAGAGGAGACAAGTCGTAACATGGTAA-3′，TaqMan MGB探針為5′- FAM-CGTCACCCTCCTCAAG -MGB 3′。PCR反應(yīng)體系為10 μl體系，包含2×Hotstart Taq PCR Mastermix5 μl(包括dNTPs、Buffer、MgCl2和Taq DNA polymerase,北京天為時(shí)代公司)，50 ng/L的模板DNA0.5 μl， 2 μmol/L的正向引物、反向引物各1 μl和2 μmol/L的針對(duì)1494C位點(diǎn)的探針0.5 μl(上海基康生物技術(shù)公司)，ddH2O加至10 μl。將上述試劑加入0.2 ml薄壁管中，輕彈混勻，短暫離心后進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min，隨后95 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火時(shí)采集熒光。PCR反應(yīng)在Corbert Research 公司的Rotor-GenePCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。每組PCR反應(yīng)均設(shè)有陽(yáng)性對(duì)照、正常對(duì)照及只加水、不加DNA 模板的空白對(duì)照。

1.4樣本測(cè)序 測(cè)序用引物序列為：F 5'CGCCATCTTCAGCAAACCCT 3'，R 5'TGCGCCAGGTTTCAATTTCTATC 3'，擴(kuò)增片段468 bp。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性0.30 min，55 ℃復(fù)性0.30 min，72 ℃延伸0.30 min，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)終止后再72 ℃延伸5 min。對(duì)所有陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行Big-Dye測(cè)序，測(cè)序在美國(guó)ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer測(cè)序儀上測(cè)序。測(cè)序的樣本包括所有的real-time qPCR檢測(cè)陽(yáng)性樣本，以及3 119例陰性樣本中隨機(jī)選擇的495例。

1.5結(jié)果判定 根據(jù)Roter-gene 6軟件對(duì)所記錄的熒光釋放量進(jìn)行分析，如果曲線為不同顏色規(guī)整的S形曲線則判為陰性，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的熒光探針能與擴(kuò)增產(chǎn)物完全結(jié)合，而C1494T突變時(shí)該探針不能與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，故沒(méi)有 S形熒光曲線出現(xiàn)，由此判斷發(fā)生突變(圖1)。

2 結(jié)果

3 133例檢測(cè)樣本中發(fā)現(xiàn)C1494T突變14例，其中，河南安陽(yáng)4例、新疆2例、青海西寧1例、云南昆明2例、安徽阜陽(yáng)2例、四川成都2例、福建福州1例，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證全部為C1494T突變(圖2)，總的突變攜帶率為0.45%(14/3 133)。14例中4例有明確氨基糖苷類(lèi)抗生素使用史，8例為語(yǔ)前聾，2例語(yǔ)后聾，4例性質(zhì)不明。495例real-time qPCR檢測(cè)陰性樣本經(jīng)測(cè)序證實(shí)均無(wú)C1494T突變。

3 討論

Real-time qPCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入能特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物的熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，得到S形的擴(kuò)增曲線。在突變的診斷方面，對(duì)于基因突變?cè)O(shè)計(jì)跨突變位點(diǎn)片段的熒光探針，然后對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，直接觀察熒光的有無(wú)，免去了常規(guī)PCR后的電泳檢查過(guò)程，其敏感性大大超過(guò)常規(guī)PCR。本研究使用的Taq-Man MGB探針3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是一種基本無(wú)熒光本底的小溝結(jié)合物(minor groove binder，MGB)，取代了常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記，使得熒光本底大大降低，從而提高了分辨率；探針3′端結(jié)合的MGB使得探針的Tm值有近10 ℃的提高，提高了配對(duì)序列與非配對(duì)序列的差異，從而使探針的雜交穩(wěn)定性和特異性顯著增強(qiáng)[11]。另外探針長(zhǎng)度縮短，淬滅基團(tuán)與報(bào)告基團(tuán)在空間位置上更加接近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確。應(yīng)用TaqMan探針進(jìn)行基因突變的檢測(cè)一般基于2條探針，1條探針為突變型探針，另1條為野生型探針，均橫跨突變位點(diǎn)，2條探針用2種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。本研究?jī)H使用野生型探針，擴(kuò)增結(jié)束時(shí)根據(jù)熔解曲線判斷是否有基因突變，若有基因突變，則無(wú)熒光產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對(duì)mtDNA C1494T突變?cè)O(shè)計(jì)跨越突變位點(diǎn)的野生型熒光探針檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，而且降低了設(shè)計(jì)成本。

圖1 real-time qPCR檢測(cè)mtDNA C1494T突變

圖2 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果陰影部分為突變堿基，箭頭所指為突變峰

2004年首先在一個(gè)中國(guó)大家系中報(bào)道了mtDNA C1494T突變，mtDNA 1494位點(diǎn)的胞嘧啶C位于12SrRNA基因的A位點(diǎn)，有明確的生物化學(xué)和功能結(jié)構(gòu)方面的證據(jù)證明C1494T突變和氨基糖苷類(lèi)(AmAn)藥物誘發(fā)的耳聾密切相關(guān)，并且與母系遺傳性聾家系有關(guān)[5]。Zhao等[12]通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)研究了巴龍霉素對(duì)攜帶mtDNA C1494T突變細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響，認(rèn)為C1494T突變可以造成細(xì)胞對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的超敏性，mtDNA C1494T突變和氨基糖苷類(lèi)藥物中毒性聾和NSHL有直接的關(guān)系。人線粒體12SrRNA的結(jié)構(gòu)和序列與細(xì)菌的16SrRNA 類(lèi)似，12SrRNA是參與構(gòu)成30S小亞基的分子。mtDNA1494位點(diǎn)位于mtDNA 12SrRNA 倒數(shù)第2個(gè)螺旋柄的基部,此部位在進(jìn)化上是高度保守的，mtDNA C1494T突變使第2個(gè)柄基部出現(xiàn)一個(gè)新的堿基U,這就使它能和與之相對(duì)的1555位點(diǎn)上的A配對(duì),根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)分析，配對(duì)的核苷酸比不配對(duì)時(shí)占有的空間小,同時(shí)突變引入一對(duì)氫鍵,使12SrRNA與AmAn結(jié)合部位的空間增大，空間體積的變化能促進(jìn)AmAn與12SrRNA結(jié)合區(qū)域的結(jié)合。這種變化阻礙了線粒體核糖體蛋白質(zhì)的合成,使氧化磷酸化過(guò)程受阻而影響ATP的合成,使Na+、K+、Ca2+離子泵失能，進(jìn)而導(dǎo)致聽(tīng)毛細(xì)胞逐漸死亡,結(jié)果引起永久性聾[1,13]。

mtDNA C1494T突變引起的耳聾表型特征為雙側(cè)對(duì)稱性、以高頻聽(tīng)力下降為主的感音神經(jīng)性聾，可以表現(xiàn)為正常聽(tīng)力到極重度感音神經(jīng)性聾[5,6]。C1494T突變類(lèi)似于A1555G突變，Zhao等[5]發(fā)現(xiàn)C1494T突變致聾一般表現(xiàn)為語(yǔ)后聾或者藥物誘發(fā)的耳聾。本研究發(fā)現(xiàn)mtDNA C1494T突變致聾主要表現(xiàn)為語(yǔ)前聾，因此，mtDNA C1494T突變致耳聾可以有不完全的聽(tīng)力損失外顯率，在AmAn等環(huán)境因素以及在其他遺傳因素如核修飾基因參與下而發(fā)生耳聾[5,7]。

本研究結(jié)果顯示，mtDNA C1494T突變?cè)谥袊?guó)耳聾人群中的發(fā)生率為0.45%，其發(fā)生率并不高。Li等[2]在溫州特教學(xué)校的128名耳聾學(xué)生中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)C1494T突變，與本研究結(jié)果一致，證明了該突變?cè)谥袊?guó)耳聾人群中較為罕見(jiàn)。由于攜帶率很低，對(duì)于河南安陽(yáng)相對(duì)較高的發(fā)生率，沒(méi)有證據(jù)支持是由于地區(qū)或者民族間的不同導(dǎo)致的，考慮C1494T突變是一偶然現(xiàn)象，單倍型分析應(yīng)該來(lái)自不同的單倍型。Wang等[14]從種系發(fā)生的角度研究C1494T突變，認(rèn)為該突變是一個(gè)相當(dāng)罕見(jiàn)的現(xiàn)象，它的單體型A背景不太可能對(duì)C1494T突變的外顯率起作用。因此認(rèn)為，可以不考慮將C1494T列為聾病基因的一線常規(guī)檢測(cè)位點(diǎn)。

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