即早基因c-Jun在順鉑誘發(fā)豚鼠耳蝸Corti器細(xì)胞凋亡中的作用△

邢奮麗 鄧毅 王林娥 曹克利

即早基因c-Jun是絲裂素活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成分，與神經(jīng)元凋亡過程密切相關(guān)，負(fù)責(zé)凋亡早期觸發(fā)階段的信號放大及傳遞，其表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[1]。c-Jun在機(jī)體其他組織的表達(dá)已有報道[2，3]，但c-Jun在豚鼠耳蝸細(xì)胞損傷中的研究尚不多見。為此，本實(shí)驗(yàn)給豚鼠腹腔注射順鉑，以制備感音神經(jīng)性聾的動物模型，用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察c-Jun在正常豚鼠耳蝸細(xì)胞的表達(dá)及耳蝸細(xì)胞凋亡時發(fā)生的改變，初步探討c-Jun在耳蝸細(xì)胞凋亡中的意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和分組 選健康白毛紅目豚鼠20只，體重250～350 g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，無中耳炎，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，于北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心潔凈飼養(yǎng)。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射順鉑4 mg·kg-1·d-1，連續(xù)4天，每天測體重以調(diào)整藥量。對照組每天腹腔注射等量生理鹽水。在給藥4天后24小時內(nèi)處死動物，每組均取動物的左側(cè)耳蝸制作石蠟切片，余備他用。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 本實(shí)驗(yàn)主要儀器有：GSI Audera 聽覺腦干誘發(fā)電位測試系統(tǒng)；GSI TIP50插入式耳機(jī)；手術(shù)顯微鏡(云南光學(xué)儀器廠)；Olympus 光學(xué)顯微鏡。主要試劑：注射用順鉑粉劑(10 mg/支，齊魯制藥廠)10 ml生理鹽水溶解，配成1 mg/ml溶液；10%水合氯醛；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(POD,武漢博士德生物有限公司 MK 1020)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB,中山公司)；一抗為c-Jun(H-79)兔多克隆抗體IgG(sc-1694)；二抗為羊抗兔抗體Envision(Dako 基因公司,即用型)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1ABR檢測 所有動物在最后一次給藥后24 h內(nèi)測試聽性腦干反應(yīng)，具體步驟：將動物置隔聲電屏蔽室內(nèi)，10%水合氯醛3～4 ml/kg腹腔注射麻醉滿意后，將針形記錄電極置豚鼠顱頂正中皮下，參考電極置同側(cè)乳突區(qū)，鼻尖接地，使針形電極和皮膚之間的電阻<5 kΩ；GSI TIP50型插入式耳機(jī)給聲，用100 μs、極性交替的短聲(click)作刺激聲，刺激重復(fù)率11.1次/秒，濾波范圍150～3 000 Hz，掃描時間10 ms，疊加253次；聲刺激強(qiáng)度自110 dB SPL開始，按10 dB一檔下降，接近反應(yīng)閾時，每次減少5 dB,以能引出可重復(fù)的波I的最小刺激聲強(qiáng)度為反應(yīng)閾。到反應(yīng)閾時，每耳測3次，取均數(shù)作為反應(yīng)閾值，比較每組動物給藥前后ABR反應(yīng)閾值、閾移變化。

1.3.2電鏡標(biāo)本制備 將動物全麻下斷頭處死取出聽泡，2.5%戊二醛灌流固定，1%鋨酸后固定，常規(guī)制備掃描標(biāo)本，日本電子SEM-6000F型掃描電鏡觀察樣品；另外，常規(guī)制備透射電鏡標(biāo)本，超薄切片，厚度約60 nm，日本電子JEM-1010透射電鏡觀察。

1.3.3石蠟切片制作及HE染色 取出左耳聽泡，于手術(shù)顯微鏡下打開，常規(guī)切片，厚度為5～6 μm，玻片用多聚賴氨酸處理。取中軸切片，每隔5張選一張，每個標(biāo)本選2張進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測，2張做c-Jun蛋白染色，余下的切片每組動物中每個指標(biāo)各選2張做陰性對照。組織切片HE染色，證實(shí)為完整的耳蝸組織，光鏡下觀察。

1.3.4原位檢測凋亡細(xì)胞及TUNEL陽性細(xì)胞半定量分析 用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，采用原位染色TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞，操作參考試劑盒推薦方法稍加改動。結(jié)果在顯微鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞，于200倍光鏡下觀察分析每張切片底回蝸軸兩側(cè)Corti器細(xì)胞，用北航數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像處理軟件，單點(diǎn)分割圖像，記錄陽性細(xì)胞總數(shù)。

1.3.5c-Jun蛋白免疫組化染色(二步法)及結(jié)果判定 石蠟切片，二甲苯脫蠟，3%過氧化氫室溫孵育；下行梯度酒精水化至水；PBS沖洗；抗原修復(fù)；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(預(yù)實(shí)驗(yàn)選定一抗稀釋度為c-Jun 1:300)，室溫孵育，PBS沖洗；滴加二抗：羊抗兔Envision，PBS沖洗；DAB顯色，顯微鏡控制；蘇木素復(fù)染；鹽酸酒精分化；氨水返蘭；上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。用北航數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，單點(diǎn)分割圖像，體視學(xué)分析，每張切片用平均光密度值(mean optical density，MOD)代表該切片的染色強(qiáng)度，于200倍光鏡下對每張切片底回蝸軸兩側(cè)Corti器細(xì)胞進(jìn)行分析，每個標(biāo)本選兩張切片，取其平均值作為該標(biāo)本的染色強(qiáng)度。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析，對各組動物給藥前后ABR閾值差進(jìn)行成組設(shè)計t檢驗(yàn)；對TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞記數(shù)結(jié)果用成組設(shè)計兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test)；兩組動物細(xì)胞內(nèi)c-Jun蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組和對照組ABR反應(yīng)閾 實(shí)驗(yàn)組動物給藥前后ABR反應(yīng)閾分別為37.75±5.50和54.25±9.07 dB SPL(t=6.628,P<0.05)，對照組動物給藥前后ABR閾值分別為37.00±6.16和39.50±4.26 dB SPL(t=1.602,P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組ABR閾移為16.00±10.71 dB，對照組ABR閾移為1.75±6.12 dB，兩組閾移比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.164,P<0.05)，說明實(shí)驗(yàn)組豚鼠發(fā)生了感音神經(jīng)性聾。

2.2電鏡觀察結(jié)果 掃描電鏡見實(shí)驗(yàn)組耳蝸毛細(xì)胞散亂、倒伏，毛細(xì)胞纖毛周圍滲出物形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而對照組毛細(xì)胞纖毛周圍無網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包繞附著；透射電鏡見實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡改變，表現(xiàn)為核內(nèi)染色質(zhì)邊聚，對照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，沒有明顯凋亡變化(圖1、2)。

2.3HE染色觀察結(jié)果 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞數(shù)目減少，排列散亂，細(xì)胞體積變小(圖3)。

2.4原位染色檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞數(shù)目減少，排列散亂，細(xì)胞體積變小，同時可見明顯的凋亡陽性細(xì)胞，對照組凋亡細(xì)胞染色幾乎均為陰性，只在個別支持細(xì)胞有弱陽性，陰性對照片細(xì)胞均未著色。統(tǒng)計結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組10例耳蝸Corti器的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)分別為1.0、2.0、1.5、1.0、2.5、0.5、3.0、0.0、3.5、4.0，對照組Corti器的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)分別為0.5、0.0、1.0、0.0、0.75、0.0、0.5、0.25、0.0和0.0，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，兩組Corti器TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z為-2.959，P<0.05)(圖4)。

2.5c-Jun蛋白表達(dá)檢測結(jié)果 對照組中，c-Jun蛋白在內(nèi)耳廣泛分布，包括螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和Corti器細(xì)胞，蝸軸神經(jīng)未見表達(dá)，Corti器中部分支持細(xì)胞也有表達(dá)，染色較淺；實(shí)驗(yàn)組中，Corti器細(xì)胞c-Jun染色明顯增強(qiáng)，以胞核明顯，同時細(xì)胞體積變小(圖5)。實(shí)驗(yàn)組和對照組Corti器細(xì)胞c-Jun的MOD值分別為0.51±0.08和0.33±0.07，實(shí)驗(yàn)組耳蝸細(xì)胞c-Jun表達(dá)明顯增強(qiáng)(t=5.359，P<0.05)。

圖1兩組豚鼠耳蝸掃描電鏡圖a 對照組耳蝸毛細(xì)胞纖毛周圍無滲出(掃描電鏡×850),b 實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)胞纖毛周圍有滲出，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(掃描電鏡×550)

圖2兩組豚鼠耳蝸透射電鏡圖a 對照組毛細(xì)胞形態(tài)正常，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,b 實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)胞體積變小，核膜皺縮，染色質(zhì)邊聚(透射電鏡×5 000)

圖3兩組豚鼠耳蝸HE染色圖a 對照組耳蝸Corti器細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊,b 實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞，數(shù)目減少，排列散亂(HE×400)

圖4原位染色結(jié)果a 對照組耳蝸Corti器細(xì)胞TUNEL染色，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞均為陰性,b 實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞TUNEL染色，外毛細(xì)胞和部分支持細(xì)胞核顯棕色，為陽性細(xì)胞(×200)

圖5 c-Jun蛋白表達(dá)免疫組化染色圖a 對照組c-Jun在Corti器內(nèi)外毛細(xì)胞染色較弱，部分支持細(xì)胞染色也表現(xiàn)為弱陽性，b 實(shí)驗(yàn)組c-Jun在Corti器細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，支持細(xì)胞和外毛細(xì)胞染色加深明顯(免疫組化染色×400)

3 討論

順鉑是常用的抗腫瘤藥，尤其對實(shí)體瘤和對一般化療不甚敏感的腫瘤療效顯著，臨床應(yīng)用十分廣泛。但其有嚴(yán)重腎功能損傷、耳毒性等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者化療期及化療后的生活質(zhì)量[4]。近年來，在順鉑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，合成了大量的順鉑類似物，但總體抗腫瘤水平都沒有超過順鉑，而且抗瘤譜窄，所以，暫不可能取代順鉑。為減小順鉑的毒副作用，順鉑的耳毒性機(jī)制一直是耳科學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。

多年來豚鼠一直被用于內(nèi)耳實(shí)驗(yàn)，主要由于不同哺乳動物對耳毒性藥物的敏感性不同，而豚鼠對耳毒性藥物最敏感，損傷后內(nèi)耳的變化與人類損傷后相似，而且豚鼠內(nèi)耳體積大，操作容易。因此本實(shí)驗(yàn)選用豚鼠，在順鉑導(dǎo)致豚鼠耳聾后，觀察耳蝸Corti器細(xì)胞凋亡及c-Jun在豚鼠耳蝸的表達(dá)情況。

研究發(fā)現(xiàn)，順鉑引起耳毒性主要為不可逆的感音神經(jīng)性聾[4]，臨床上聽力損失以高頻為主，雙側(cè)對稱，逐漸波及中低頻區(qū)。順鉑在內(nèi)耳淋巴中維持高濃度，首先損傷外毛細(xì)胞，其中第一排外毛細(xì)胞受損最重，而且病變從底回開始，逐漸向蝸尖發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)給豚鼠腹腔注射順鉑制備感音神經(jīng)性聾動物模型，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組豚鼠ABR反應(yīng)閾顯著提高，閾移明顯大于對照組，石蠟切片和電鏡掃描觀察結(jié)果顯示，順鉑導(dǎo)致動物耳蝸細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，耳蝸細(xì)胞中出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。

一般情況下，細(xì)胞內(nèi)存在少量c-Jun蛋白，參與細(xì)胞的信息傳遞等生理過程，不同的生理和病理性刺激如缺血、缺氧、射線輻射、應(yīng)激等可以誘導(dǎo)其表達(dá)增加，c-Jun表達(dá)變化與某些疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而且參與了應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常情況下，c-Jun彌散分布在Corti器的部分毛細(xì)胞、支持細(xì)胞中，表達(dá)較弱，胞核中表達(dá)不明顯，耳蝸細(xì)胞發(fā)生凋亡時可見c-Jun蛋白表達(dá)水平明顯增高，胞核中表達(dá)尤其明顯，推測c-Jun可能參與了順鉑導(dǎo)致的耳蝸細(xì)胞凋亡。JNK/c-Jun途徑在內(nèi)耳研究中被認(rèn)為是引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致聽覺神經(jīng)元凋亡的主要因素[6，7]，結(jié)合目前研究，推測順鉑是通過增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物如ROS、NO、Ca2+等激活JNK/c-Jun通路，使c-Jun表達(dá)增強(qiáng)并轉(zhuǎn)位入核所致，在細(xì)胞核內(nèi)c-Jun與自身、cfos或活化轉(zhuǎn)錄因子2(activating transcription factor-2,ATF2)等形成同源或異源二聚體，并結(jié)合到有與轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)特異結(jié)合位點(diǎn)的凋亡相關(guān)的下游基因DNA調(diào)節(jié)區(qū)，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄速度，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8，9]，從而引起感音神經(jīng)性聾。

目前，c-Jun是絲裂素活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個干預(yù)治療的潛在分子靶[10]，本實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)凋亡耳蝸細(xì)胞的c-Jun表達(dá)高于正常耳蝸，但是c-Jun在耳蝸細(xì)胞凋亡過程中的動態(tài)變化及與其他MAPK分子之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究，以便為臨床上感音神經(jīng)性聾的防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

1 Greer JE, McGinn MJ, Povlishock JT. Diffuse traumatic axonal injury in the mouse induces atrophy, c-Jun activation, and axonal outgrowth in the axotomized neuronal population[J]. J Neurosci,2011,31:5 089.

2 趙曉鴻,陳照麗,趙守華,等. COX-2及其轉(zhuǎn)錄因子NFAT3和c-Fos在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J].中國肺癌雜志，2010，11:1 035.

3 Xu P, Das M, Reilly J, et al. JNK regulates FoxO-depen-dent autophagy in neurons[J]. Genes Dev,2011,25:310.

4 Rybak LP. Mechanisms of cisplatin ototoxicity and progress in otoprotection[J]. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg,2007,15:364.

5 Ganm C, Holnmin S, Mathiesen T. Temporal profiles and cellular sources of three nitric oxide sythases isoforms in the brain after experimental contusion[J]. Neurosurgery,2000, 46:169.

6 Shalini S, Bansal MP. Co-operative effect of glutathione depletion and selenium induced oxidative stress on API and NFkB expression in testicular cells in vitro: insights to regulation of spermatogenesis[J]. Biol Res,2007,40:307.

7 許輝杰，黃魏寧. 順鉑作用下沙鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和Corti器細(xì)胞的凋亡[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2003，38：98.

8 Marek KW, Kurtz LM, Spitzer NC. c-Jun integrates calcium activity and tlx3 expression to regulate neurotransmitter specification[J]. Nat Neurosci,2010,13:944.

9 Lefebvre P ,Malgrange B, Lallemend F,et al. Mechanisms of cell death in the injured auditory system:otoprotective strategies[J]. Audiol Neurotol, 2002, 7:165.

10 Martin LJ,Bergeron F,Viger RS,et al. Functional cooperation between GATA factors and c-Jun on the star promoter in MA-10 leyclig cells[J]. J Androl,2012,33:81.