五指山豬與長(zhǎng)白豬65 d胎兒組織MRFs家族基因的表達(dá)研究

曹 婷，施力光，張立嶺，荀文娟，周漢林，黃顯州，侯冠彧＊

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所／農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州571737；2.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 海口570228）

豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)肉性狀形成分子機(jī)制一直是動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)，解析產(chǎn)肉性狀形成的分子機(jī)制，是有效開發(fā)利用地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性和培育優(yōu)良新品種的關(guān)鍵［1］。五指山豬在作為模式動(dòng)物研究的同時(shí)，其優(yōu)良種質(zhì)特性，如背肌厚、脂肪含量低、風(fēng)味氨基酸含量高等作為特色高檔肉食品開發(fā)意義重大，但是具有生長(zhǎng)慢、體型小的缺點(diǎn)［2］。本試驗(yàn)以五指山豬和生長(zhǎng)速度較快但肉質(zhì)稍差的長(zhǎng)白豬為研究對(duì)象，分析肌生成調(diào)控因子MRFs基因家族成員在以上兩種豬妊娠期65 d胎兒組織中mRNA表達(dá)情況，為探索肌肉生長(zhǎng)發(fā)育差異機(jī)制、系統(tǒng)選育及控制體型大小提供參考［3-4］。

肌生成調(diào)控因子MRFs基因家族在動(dòng)物肌肉形成和發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。MRFs基因家族成員包括Myo D 1、Myf4、Myf5和Myf6四種基因，其中Myo D1和Myf5最先表達(dá)，主要負(fù)責(zé)調(diào)控肌細(xì)胞的增值和調(diào)節(jié)生肌細(xì)胞系的定向作用，隨后Myf4和Myf6基因進(jìn)一步完成肌纖維的形成，它們的缺失可以直接或者間接導(dǎo)致肉品質(zhì)和產(chǎn)肉量的降低［5-7］。因此，對(duì)MRFs基因家族成員在不同組織表達(dá)量的研究，可以為進(jìn)一步提高肉品質(zhì)和肉產(chǎn)量提供一定理論依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步深入研究影響五指山豬或其他動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和體型大小機(jī)制提供借鑒［3-4］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)妊娠期65 d五指山豬和長(zhǎng)白豬各一頭，快速處死，將胎盤取出，分別采集2個(gè)胎兒不同組織，放于液氮，備用。

1.2 試劑及儀器

主要試劑RNAiso Plus總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq TM）均購自大連寶生物工程有限公司；主要儀器：核酸濃度測(cè)定儀（Nano Vue，美國(guó)GE），PCR儀（Biometra），凝膠成像系統(tǒng)，小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）、熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf），SA-960-2超凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司），移液槍（physiocare），熒光定量PCR八聯(lián)管套裝（Axygen）。

1.3 qPCR

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 按試劑盒說明提取各組織總RNA，核酸紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度，稀釋備用。

反轉(zhuǎn)錄：Total RNA 0.5μL；Prime Script TM RT Enzyme MixⅠ0.5μL；5×prime Script TM Buffer終濃度1×；Random 6 mers終濃度50 pmol；Oligo d T Primer終濃度 25 pmol；RNase Free d H2O Up to 10μL。37℃，15 min；85℃，5 s。放于-20℃冰箱待用。

1.3.2 引物 Primer5設(shè)計(jì)引物，上海生工生物合成，見表1。

表1 RT-PCR引物信息Table 1 Real time RT-PCR primer information

1.3.3 qPCR 試 驗(yàn) 采 用 realplex4qPCR 儀，SYBR Green I染料二步法，25μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq TM 12.5μL，引物1μL（10 μmol／L），c DNA模板2μL，dd H2O 9.5μL。預(yù)熱95℃60 s，變性95.0℃10 s；退火61℃20 s；循環(huán)40次。

1.4 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

參考 Winer等的方法［8］，在保證以上四種基因擴(kuò)增效率的前提下，分別以各個(gè)基因在五指山豬胎兒腿部骨骼肌中的表達(dá)水平為標(biāo)準(zhǔn)量，2-△△Ct法結(jié)合內(nèi)參基因運(yùn)算目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)情況（每個(gè)基因都有個(gè)Ct值，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；△Ct＝目的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct；△△Ct＝標(biāo)準(zhǔn)量的△Ct與其他△Ct的差；相對(duì)表達(dá)量則為2-△△Ct）。SAS軟件數(shù)據(jù)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

MRFs基因家族成員在五指山豬與長(zhǎng)白豬65 d妊娠期胎兒各組織中m RNA相對(duì)表達(dá)情況分析結(jié)果見圖1～4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，MRFs家族成員除在肝、腎、腸組織以外，在五指山豬65 d胎兒組織中mRNA表達(dá)水平均高于長(zhǎng)白豬65 d胎兒相應(yīng)組織中的表達(dá)水平（P＜0.05）；mRNA表達(dá)水平在腿肌和背肌中的表達(dá)普遍偏高，其他組織中表達(dá)較低（P＜0.05）；2個(gè)豬種在以上10種組織中MRFs家族mRNA表達(dá)水平高低分布基本一致，在腿部和背部骨骼肌及肝臟、肺和胃組織MRFs基因家族mRNA表達(dá)量較高，腎、腸和心臟中的表達(dá)量較低，相對(duì)表達(dá)量高低順序?yàn)椋和炔抗趋兰。颈巢抗趋兰。靖危痉危疚福酒ⅲ灸X＞腎＞腸＞心。

圖1 Myo D1基因在五指山豬和長(zhǎng)白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 MyfoD1 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

圖2 Myf4基因在五指山豬和長(zhǎng)白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Myf4 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

圖3 Myf5基因在五指山豬和長(zhǎng)白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Myf5 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

圖4 Myf6基因在五指山豬和長(zhǎng)白豬65 d妊娠期胎兒各組織中mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Myf6 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

3 討 論

目前，中國(guó)是世界上最大的養(yǎng)豬和豬肉產(chǎn)品消費(fèi)國(guó)。隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)豬肉的要求也日益增大，豬的生長(zhǎng)速度和瘦肉率的提升也越顯重要，但目的性的選育難免會(huì)降低其他相關(guān)肉品質(zhì)，所以越來越多的肉品質(zhì)優(yōu)化問題日益顯著起來［9］。五指山豬原產(chǎn)于海南，具有遺傳穩(wěn)定、抗逆性強(qiáng)、背肌厚、膘少、代謝率低、氨基酸組成豐富等諸多特點(diǎn)［3-4］，但缺點(diǎn)是體形矮小、生長(zhǎng)緩慢［2］。長(zhǎng)白豬原產(chǎn)于丹麥，具生長(zhǎng)速度快、體型大、屠宰率高等優(yōu)點(diǎn)［3-4］，缺點(diǎn)是肉質(zhì)欠佳［10］。不同品種的豬各具優(yōu)缺點(diǎn)，如何結(jié)合相應(yīng)優(yōu)點(diǎn)培育出滿足消費(fèi)者要求的品種是改善和提升肉品質(zhì)的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過熒光定量等方法比較和分析五指山豬和長(zhǎng)白豬妊娠65 d胎兒腿部、背部骨骼肌及各內(nèi)臟器官組織中控制肌肉生成和發(fā)育的MRFs基因家族的mRMA的表達(dá)差異，結(jié)果顯示除肝、腎和腸以外，MRFs基因家族m RMA的表達(dá)在五指山豬胎兒組織中普遍高于長(zhǎng)白豬胎兒組織中的表達(dá)，且兩種豬肌肉組織中的表達(dá)差異明顯。因此，導(dǎo)致五指山豬和長(zhǎng)白豬肉品質(zhì)和生長(zhǎng)速度及體型的差異很可能與MRFs基因家族表達(dá)的差異有直接關(guān)系。對(duì)日后深入研究控制肌肉生長(zhǎng)、發(fā)育機(jī)理和肉質(zhì)性狀發(fā)育，以及為控制豬種體型大小的形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

肉品質(zhì)性狀的表現(xiàn)很復(fù)雜，受遺傳及環(huán)境影響。遺傳因素表現(xiàn)在動(dòng)物出生前骨骼肌的形成，由肌纖維構(gòu)成，形成過程在妊娠期70 d左右完成，出生后只增大肌纖維體積，數(shù)量并不增加［2-4，11］。肌肉的形成和日后的生長(zhǎng)主要由MRFs基因家族成員調(diào)控［3-6］。MRFs基因家族分為兩類，一類是先表達(dá)的Myo D1和Myf5基因，稱為初級(jí)MRFs，表達(dá)在成肌細(xì)胞增殖過程中，在生肌細(xì)胞系的定向中起調(diào)節(jié)作用；一類是 MyoG 及Myf6基因，稱為次級(jí)MRFs，對(duì)肌纖維的形成具有進(jìn)一步完成作用［3-5，7］。在胚胎發(fā)過程中，Myf5是肌細(xì)胞中最先被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，接下來表達(dá)的是 Myo D1、Myf5與Myo D1，它們之間有互補(bǔ)代償作用，兩種基因同時(shí)缺失會(huì)導(dǎo)致分化和形成的骨骼肌和成肌細(xì)胞不出現(xiàn)。由此可見，Myf5與MyoD1基因在肌肉形成上的重要作用［3-4，11-12］。Myf4是唯一在骨骼肌細(xì)胞系中都能表達(dá)的MRFs成員，在肌細(xì)胞分化中的正調(diào)控作用不可替代，調(diào)控肌細(xì)胞融合的起始，促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步使單核成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪思±w維，決定骨骼肌特異表型，并影響產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)［3，4，13-18］。Myf4 的位點(diǎn)突變會(huì)影響氨基酸序列、功能或改變?cè)摶蛟谂咛グl(fā)育時(shí)期的表達(dá)方式及水平，直接影響產(chǎn)肉量［3，4，19-22］。Myf6的作用及機(jī)理更加復(fù)雜，它的激活主要存在于動(dòng)物出生后，具有促進(jìn)次級(jí)肌纖維形成的調(diào)節(jié)作用，并在肌肉表型維持和肌纖維形成起著重要作用，是唯一能存在于成熟神經(jīng)節(jié)中的MRFs成員。Myf6基因與MyoG基因有很大的同源性，共同控制肌肉的分化。在肌肉的分化過程中這兩個(gè)基因幾乎同時(shí)表達(dá)，Myf6的自身突變能影響Myf5的表達(dá)，可以間接影響肌肉的產(chǎn)量［3-4，23］。本研究結(jié)果顯示，無論在五指山豬胎兒還是在長(zhǎng)白豬胎兒組織中，都是在骨骼肌中MRFs基因家族的mRNA的表達(dá)水平最高，且明顯高于其他組織，說明該基因家族在肌肉的發(fā)育行程中起到了重要的正向調(diào)節(jié)作用；MRFs基因家族的基因在五指山豬胎兒肌肉中的mRNA表達(dá)普遍高于在長(zhǎng)白豬胎兒骨骼肌中的表達(dá)，表明不同豬種間肌肉發(fā)育的差異與MRFs基因家族的表達(dá)水平的差異可能有直接聯(lián)系。這些結(jié)果有可能體現(xiàn)MRFs基因家族在肌肉組織生成和發(fā)展的關(guān)鍵作用的依據(jù)，以及為MRFs的表達(dá)水平導(dǎo)致肉質(zhì)性狀不同提供參考。因此，研究MRFs基因家族成員的作用機(jī)理和互作關(guān)系為日后進(jìn)一步了解肌肉和其他組織的生長(zhǎng)發(fā)育和變化規(guī)律提供一定的參考。

［1］ 王軍軍.不同豬種間MRFs家族及OB基因的結(jié)構(gòu)差異［D］.吉林長(zhǎng)春：中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)，2003.

［2］ 侯冠彧，周漢林，王東勁，等.五指山豬8種組織IGF2和IGFBP3基因［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，31（5）：9-12.

［3］ 曹 婷，侯冠彧，施力光，等.五指山豬不同組織中 Myf5與MyoD1基因的表達(dá)研究［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，33（5）：1-4.

［4］ 曹 婷，施力光，周漢林，等.五指山豬不同組織中肌細(xì)胞生成素基因Myf4及生肌調(diào)節(jié)因子Myf6的表達(dá)［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)2012，31（5）：1-5.

［5］ 楊明娟，陳 宏.牛MRFs基因家族研究進(jìn)展［J］.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2010，36（6）：51-55.

［6］ 劉丑生，趙興波，李 寧，等.動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的功能基因研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧雜志，2003，39，（5）：48-49.

［7］ 湯展毅，嚴(yán)云勤，高學(xué)軍，等.牛Myf6基因克隆及在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)［M］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（11）：77-82.

［8］ Winer J，Jung C K S，Shackel I，et al.Development and Validation of Real-Time Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction for Monitoring Gene Expression in Cardiac Myocytesin Vitro［J］.Analytical Biochemistry，1999，270：41-49.

［9］ 楊曉靜.豬骨骼肌生長(zhǎng)及及纖維類型分布的分子機(jī)理研究［D］.江蘇南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［10］ 單立莉，張 敏，苗志國(guó)，等.Myogenin mRNA豐度在金華豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：374-388.

［11］ 丁國(guó)杰，劉 娣，李景芬.豬Myf5基因外顯子1的多態(tài)性分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（3）：125-127.

［12］ Daumas G，Dhorne T.Teneur en viande maigre des carcasses deporc：E′valuation et estimation［J］.Journe′es de la Recherche Porcine en France，1997，29：411-418.

［13］ Hasty P，Bradley A，Morris J H，et al.Muscle deficiecy and neonatal death in mice with a targeted muation in the myogenin gene［J］.Nature，1993，364：501-506.

［14］ Wright W E.Sassoon D A，V K Lin.Myogenin afactor regularing myogenesis has a domain homologous to MyoD［J］.Cell，1989，56（4）：607-617.

［15］ Olson E N.Molecular control of myogenesis：antagnonism between growth differentiation［J］.Molecucar Cell Biochemical，1991，104：7-13.

［16］ 林萬華，黃路生，艾華水，等.MyoG基因型對(duì)二臉花豬早期生長(zhǎng)性狀及肌肉組織學(xué)特征的影響［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002，10（4）：367-372.

［17］ 王 珊，陳 宏，蔡 欣.牛MyoG基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，34（8）：12-16.

［18］ 張力鵬，張 東，蔡 欣.牛MRF4基因的電子克隆與分析［J］.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2007，33（6）：1-4.

［19］ 趙 進(jìn)，聶光軍，張金枝，等.MyoG基因?qū)鹑A豬繁殖性狀的影響［J］.遺傳，2005，27（6）：893-897.

［20］ Hughes S M，Schiaffino S.Control of muscle fibersize：a crucial factor in ageing［J］.Acta Physiologica Scandinavica，1999，167：307-312.

［21］ Naidu P S，Ludolph D C，To R Q，et al.Myogenin and MEF2 function synergistically to activate the MRF4 promoter duringm yogenesis［J］. Molecular and Cellular Biology，1995，15（5）：2 707-2 718.

［22］ Buonanno A，Edmondson D C，W P Hayes.Upstream sequences of the myogenin gene convey responsiveness to skeletal muscle denervation in transgenic mice［J］.Nucleic Acids Research，1993，21（24）：5 684-5 693.

［23］ Schnapp E，Pistocchi A S，Karampetsou E.Induced early expression of mrf4 but not myog rescues myogenesis in the myod／myf5 double morphant zebrafish embryo［J］.Journal of Cell Science，2009，122：481-488.