發(fā)酵液中維生素B12檢測方法的比較

李 莎，劉永飛，陳菲云，石 楊，張大偉＊，冉多良

（1，新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊830052；2，中國科學院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300380）

維生素B12又叫鈷胺素，高等動物和植物不能制造維生素B12，自然界中的維生素B12都是微生物合成。微生物合成的鈷胺素包括羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素以及氰基鈷胺素［1］。其中羥基鈷胺素和氰基鈷胺素為維生素B12的穩(wěn)定存在形式，氰基鈷胺素是在其它三種存在形式中人工加入氰基基團轉(zhuǎn)化而成。所以準確檢測微生物中羥基鈷胺素的含量可以確定維生素B12的產(chǎn)量。

發(fā)酵作為生產(chǎn)維生素B12的有效方法，生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高被廣泛應用。但是培養(yǎng)過程中需要加入前體物5、6-二甲基苯并咪唑（DMB）、成分復雜的玉米漿作為氮源、以及嵌合的鈷原子等培養(yǎng)基［2］。培養(yǎng)基成分復雜，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生的其他發(fā)酵產(chǎn)物對維生素B12的檢測具有很大的干擾作用。目前采用的方法主要有 TLC［3］、HPLC［4］。維生素B12檢測方法的優(yōu)化對高產(chǎn)菌株篩選以及生產(chǎn)菌株的篩選具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試 劑 羥基鈷胺素（hydroxycobalamin），購自sigma公司。硅膠G預制板，購自青島海洋化工廠。乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），KHPO（分析純），HPO（分析純）

1.1.2 儀 器 Agilent1260高效液相色譜分析儀（VWD檢測器），Bruke質(zhì)譜分析儀，色譜柱C18（5 μm，4.6 mm＊25 cm）購自大連中譜科技有限公司，紫外照射儀，sigma低溫離心機。

1.1.3 菌 種 費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）CICC：10019，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.4 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為玉米漿50 g，葡萄糖20 g，0.1%CoCl24.0 m L，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO48.0 g，蒸餾水1.0 L.p H 6.8～7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米漿50 g，葡萄糖20 g，0.1%CoCl212.0 m L，DMB 0.01g，（NH4）2SO42.0g，K2HPO48.0 g，蒸餾水1.0 L.p H 6.8～7.0。

1.2 方 法

1.2.1 標準品制備 精確稱取2 mg標準品溶解于1 m L超純水中制備成母液，逐漸稀釋為0.1 g／L，0.2 g／L，0.5 g／L，0.7 g／L，0.9 g／L標準品。

1.2.2 菌體培養(yǎng)和樣品處理［5］劃線培養(yǎng)挑取單菌落于種子培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)至OD＝3.0左右，5%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，4 000 r／min離心收集菌體，研磨破碎菌體后沸水浴中煮沸30 min，12 000 r／min離心收集上清，45μm水系濾膜過濾。根據(jù)文獻［6］中報道高產(chǎn)菌株的產(chǎn)量，樣品中加入終濃度為0.25 g／L標準品相當于高產(chǎn)菌株。對照三種方法檢測結(jié)果。

1.2.3 薄層層析（TLC）方法 硅膠G板，展開劑：甲醇-水（6∶1），樣品經(jīng)展開劑展開后將層析板在紫外照射儀中觀察結(jié)果，確定羥基鈷胺素最低濃度。

1.2.4 液相色譜條件 流動相Ⅰ：KH2PO4（50 m M，p H＝3.0），流動相Ⅱ乙腈。洗脫條件為0～5 min，10%乙腈恒速洗脫；5～15 min，10%～20%乙腈梯度洗脫；15～20 min，20%乙腈恒速洗脫。吸收波長361 nm，柱溫25℃，流速1.0 m L／min，進樣量10μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子源為電噴霧源（ESI），正離子模式；碰撞室氣體為氮氣；霧化器壓力：50 psi；干燥器流速：11 L／min，干燥器溫度：350℃；毛細管電壓：4.0 k V［7］。采用多離子反應監(jiān)測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層層析法

維生素B12可結(jié)合鈷原子，顯示為紅色，在日光燈下可觀察出Rf的大小。維生素B12結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵，可以吸收254 nm紫外線。點樣，展開劑展開后觀察標準品最低濃度均為0.5 g／L。以0.5 g／L標準品為對照定性鑒別樣品中維生素B12。發(fā)酵液中加入標準品后標準品的Rf和標準品的Rf不同，說明了發(fā)酵液會影響維生素B12的檢測，見圖1。

2.2 高效液相色譜法

圖1 薄層層析結(jié)果1.細菌破碎液；2.細菌破碎液加入0.5 g／L羥基鈷胺素標準品；3.0.5 g／L羥基鈷胺素標準品Fig.1 The results of TLC1.bacteria broken liquid；2.bacteria broken solution containing 0.5 g／L hydroxycobalamin standard；3.0.5 g／L hydroxycobalamin standard

0.1 g／L，0.2 g／L，0.5 g／L，0.7 g／L，0.9 g／L羥基鈷胺素標準品，上樣量為10μL，分別測得峰面積積分值。以峰面積積分值的對數(shù)為縱坐標，進樣量的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程：logy＝1.0012log X＋4.0371（r＝0.9997）在100～900μg范圍內(nèi)，樣品進樣量的對數(shù)值與峰面積積分值的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

發(fā)酵液中加入標準品后，保留時間從14.679 min變?yōu)?0.612 min；樣品中相似的成分很多，導致出峰較寬無法判斷是否存在維生素B12，如圖2所示。

圖2 液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram

2.3 質(zhì)譜法

試驗采用ESI源作為離子源，正離子掃描模式，以MRM方式進行定量，通過全掃描可得到維生素B12的母離子（m／z）為678.3，是其分子式（C63H88CoN14O14P）計算值加2H的一半，說明此化合物在ESI正離子模式下，生成［M＋2H］＋準分子離子峰。通過子離子掃描發(fā)現(xiàn)子離子m／z 147具有較高的相對豐度，當碰撞能量為40 V、裂解電壓為150 V時達到最大值，此值大于子離子m／z 359的最大豐度值（碰撞能量為21 V、裂解電壓為150 V）。因此選擇m／z 147作為定量離子，選擇m／z 359作為輔助定性離子。通過質(zhì)譜方法檢測，標準品和樣品中加入標準品時能夠檢測到子離子147和359，但是單純樣品中不能檢測到這兩種子離子，說明質(zhì)譜檢測方法與樣品結(jié)果相一致，準確率高。三種樣品的質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra

3 討 論

發(fā)酵液中成分復雜，為優(yōu)化檢測發(fā)酵液中穩(wěn)定存在的羥基鈷胺素方法，在發(fā)酵液中加入標準品可以視作高產(chǎn)菌株。TLC、HPLC可檢測成分簡單的產(chǎn)品中維生素B12，并且重復率高。但是發(fā)酵液中培養(yǎng)基和產(chǎn)物的成分復雜，并且維生素B12的產(chǎn)量相對過低，結(jié)果就會影響維生素B12的檢測。

通過三種檢測方法結(jié)果的對照，TLC檢測結(jié)果中高產(chǎn)菌株與標準品中維生素B12的Rf不相同，因此TLC檢測方法中發(fā)酵液影響了維生素B12的檢測。HPLC中低產(chǎn)菌株、高產(chǎn)菌株、標準品出峰時間分別為20min左右、20.612min、14.679min，HPLC重復率低偏差大。LC-MS在定性鑒別維生素B12時，高產(chǎn)菌株和標準品中都可以檢測出小分子147和359，但是樣品中卻沒有檢測出這兩種小分子物質(zhì)，說明LC-MS能夠精確檢測出發(fā)酵液中存在的微量維生素B12。LC-MS在篩選維生素B12生產(chǎn)菌株和高產(chǎn)菌株中具有重要意義。

［1］ 王 磊，張玉明，王云山，等.維生素B12的光解研究及發(fā)酵液中維生素B12檢測新方法的建立［J］.中國生物工程雜志，2006，26（4）：81-85.

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［4］ Arkadiusz Szterk，Marek Roszko，Krystian Malek，et al.Application of the SPE reversed phase HPLC／MS technique to determine vitamin B12bio-active forms in beef［J］.Meat Science，2012，91：408-413.

［5］ Alicja Kosmider，Wojciech Bialas，Piotr Kubiak，et al.Vitamin B12productio from crudeglycerol by Propionibacterium freudenreichii sp.shermanii：Optimization of medium composition through statistical experimental designs［J］.Bioresource Technology，2012，105：128-133.

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