應(yīng)用RT-PCR方法檢測鴨病毒性肝炎新型和I型病毒

柴順秀,馬 花,韓 英,趙隆壽

(青海省湟中縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所, 青海 湟中 811600)

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起的、主要危害雛鴨的一種重要病毒性傳染病，該病發(fā)病迅速，發(fā)病率高，死亡率高，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了養(yǎng)鴨業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展[1-5]。由于鴨病毒性肝炎病毒存在毒株變異，且變異程度較大，2007年臺灣和韓國學(xué)者先后證實新型DHV與典型的DHV-I在基因序列上表現(xiàn)出很大差異，且新型DHV與DHV-I不產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)[6-12]，增加了鴨病毒性肝炎綜合防控的難度。為了加快本病的病原檢測，本研究在分析I型和新型鴨病毒性肝炎病毒基因組序列的基礎(chǔ)上，選取兩種毒株的變異區(qū)分別設(shè)計了特異性檢測引物，建立了可以同時檢測鴨病毒性肝炎I型病毒和新型病毒的復(fù)合RT-PCR鑒別檢測方法，實現(xiàn)了鴨病毒性肝炎I型病毒和新型病毒的快速鑒別診斷，將為該鴨病毒性肝炎的快速檢測與診斷提供有效幫助。

1 材料與方法

1.1 毒 株

鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)、鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)、鴨瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)均由青海省西寧市動物疾病中心實驗室分離并保存。

1.2 試劑與試劑盒

Taq DAN聚合酶、一步法RT-PCR試劑盒、pMD18-T克隆載體、EcoRI與HindIII內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒基因組DNA/RNA的提取

用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒分別提取鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)、鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)、鴨瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)RNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 設(shè)計與合成引物

根據(jù)GeneBank上兩種毒株的基因組序列，選取兩種毒株的變異區(qū)分別設(shè)計了特異性檢測引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。在設(shè)計引物的過程中，所選的引物最適宜的退火溫度接近。

1.5 RT-PCR擴增反應(yīng)

分別以鴨病毒性肝炎I型病毒RNA，鴨病毒性肝炎新型病毒RNA，鴨病毒性肝炎病毒I型和新型的混合RNA為模板，進行一步法RT-PCR擴增。

反應(yīng)體系(25 μL)如下：引物(20 μmol/μL)各0.5 μL、I-DHV RNA 5 μL或N-DHV RNA 5 μL或I-DHV和N-DHV混合RNA 5 μL、one step enzyme Mix 1 μL、分別加入one step buffer至25 μL體系，RT-PCR擴增條件為：50 ℃ 60 min；95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

1.6 RT-PCR擴增產(chǎn)物的測序鑒定

分別取5 μL RT-PCR擴增產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠核酸電泳，初步觀察檢測擴增片段的大小。將擴增片段連接至pMD18-T克隆載體，提取質(zhì)粒DNA，EcoRI/HindIII雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定。

1.7 特異性試驗

分別以提取的鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)、鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)、鴨瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、健康鴨肝組織的RNA為模板，同時加入四條引物，按照上面的反應(yīng)條件進行PCR擴增，確定該檢測方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

將提取的鴨病毒性肝炎病毒I型和新型的混合RNA定量，然后10倍梯度稀釋到10-6，分別取不同稀釋度的RNA 5 μL為模板進行PCR擴增，確定該檢測方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗

利用建立的一步RT-PCR檢測方法分別對鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)、鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)、鴨瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、2份鴨病毒性肝炎I型陽性病料、2份鴨病毒性肝炎新型陽性病料、1份鴨病毒性肝炎I型和新型都陽性的病料、健康鴨肝組織重復(fù)檢測3次，確定該檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.10 符合率試驗

對本研究建立的一步RT-PCR檢測方法檢測結(jié)果為陽性的2份鴨病毒性肝炎I型病料、2份鴨病毒性肝炎新型病料、2份鴨病毒性肝炎I型和新型均陰性的病料接種10日齡鴨胚，按常規(guī)方法進行病毒的分離鑒定試驗，比較本研究建立的一步RT-PCR檢測方法與病毒分離鑒定的符合率。

1.11 臨床樣品檢測

利用建立的一步RT-PCR檢測方法檢測臨床送檢疑似鴨病毒性肝炎病毒感染的組織病料56份，對陽性的PCR擴增產(chǎn)物全部進行克隆和測序鑒定，以驗證本檢測方法的臨床適用性和準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴增結(jié)果

如圖1所示，鴨病毒性肝炎新型病毒的擴增片段大小為564 bp、鴨病毒性肝炎I型病毒的擴增片段大小為317 bp，鴨病毒性肝炎病毒I型和新型的混合RNA同時擴增出564 bp和317 bp的片段，與預(yù)期大小相一致。如圖2所示，RT-PCR擴增產(chǎn)物分別連接T載體所構(gòu)建的克隆重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切鑒定分別得到564 bp、317 bp的特異性條帶，表明RT-PCR擴增片段已經(jīng)連接到T載體。經(jīng)上海生工生物有限公司的測序鑒定表明，RT-PCR擴增片段分別為鴨病毒性肝炎病毒新型和I型的特異性片段。

2.2 特異性試驗結(jié)果

如圖3所示，鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)、鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)分別出現(xiàn)特異的與預(yù)期大小一致的片段，而鴨瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、健康鴨肝組織均沒有出現(xiàn)擴增片段，說明所設(shè)計的引物可以特異性的擴增鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)和鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)，該檢測方法有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗結(jié)果

鴨病毒性肝炎病毒I型和新型的混合RNA定量濃度為6 μg/μL，10倍梯度稀釋到10-4后，取5 μL作為RT-PCR擴增模板，檢測結(jié)果仍為陽性(如圖4所示)，說明該檢測方法可以最低檢出3 pg含量的病毒RNA，具有良好的敏感性。

圖1 RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of RT-PCR amplification productM. DL 2000 DNA Marker; 1.I-DHV;2.N-DHV;3.I-DHV andN-DHV;4.Control

圖2 克隆載體的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of cloning vectorM. DL 2000 DNA Marker; 1.I-DHV digested with EcoRI/HindIII;2.N-DHV digested with EcoRI/HindIII

圖3 特異性試驗結(jié)果Fig.3 Result of specificity testM. DL 2000 DNA Marker; 1.N-DHV; 2.I-DHV; 3.DEV;4.NDV; 5.DTMUV; 6.Healthy duck constitution; 7.Control

圖4 敏感性試驗結(jié)果Fig.4 Result of sensitive testM.DNA Marker DL 2000; 1.10-1; 2.10-2;3.10-3;4.10-4;5.10-5;2.10-6

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

經(jīng)過3次重復(fù)檢測，鴨病毒性肝炎病毒I型毒株(I-DHV)、鴨病毒性肝炎病毒新型毒株(N-DHV)、鴨瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、2份鴨病毒性肝炎I型陽性病料、2份鴨病毒性肝炎新型陽性病料、1份鴨病毒性肝炎I型和新型都陽性的病料、健康鴨肝組織結(jié)果一致，證明該檢測方法有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.5 符合率試驗結(jié)果

本研究建立的一步RT-PCR檢測方法檢測結(jié)果為陽性的2份鴨病毒性肝炎I型病料和2份鴨病毒性肝炎新型病料均分別分離到了鴨病毒性肝炎I型和鴨病毒性肝炎新型病毒，而2份陰性病料均沒有分離到病毒，RT-PCR檢測方法與病毒分離鑒定的符合率達100 %。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

利用建立的復(fù)合PCR檢測方法檢測青海湟中縣、湟源縣、大通縣及德令哈市臨床送檢病料共計56份，檢出鴨病毒性肝炎I型病毒陽性25份，鴨病毒性肝炎新型病毒陽性13份，鴨病毒性肝炎I型和新型混合感染陽性6份，對陽性的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆和測序，結(jié)果均為鴨病毒性肝炎I型或新型特異性毒株。

3 討 論

鴨病毒性肝炎病毒由于高致死率給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟損失，近年來眾多養(yǎng)鴨場不斷出現(xiàn)了不能被DHV-1弱毒疫苗或其抗血清完全控制的鴨肝炎流行，由于DHV-1的變異株新型DHV的出現(xiàn)，給本病的診斷和防控提出了更高要求[13]。由于新型鴨肝炎與I型鴨肝炎在臨床癥狀、剖檢變化等方面極為相似，如死前均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，死后呈典型的角弓反張姿勢，剖檢變化主要表現(xiàn)為肝臟的出血性壞死性變化，通過常規(guī)的臨床診斷方法很難進行鴨肝炎的鑒別診斷，這就要借助于分子生物學(xué)方法[14]，PCR檢測方法是最適合臨床病料快速檢測的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，通過PCR可以快速準確的對病原進行確診，復(fù)合PCR是用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法，在復(fù)合PCR中，所有引物Tm值應(yīng)相近。如果兩對引物Tm值差異過大，會使擴增產(chǎn)物的量明顯不同，其中一種擴增產(chǎn)物或目的條帶很難觀察到。另外，靶DNA的長度也應(yīng)相近，差別大時短片的靶DNA會優(yōu)先擴增，因此，會產(chǎn)生不同產(chǎn)量的擴增產(chǎn)物。本研究在設(shè)計引物的時候考慮到傳統(tǒng)毒株和新型變異株的不同基因組序列，分別選取可以進行鑒別診斷的特異性引物序列，在設(shè)計引物的時候，考慮到快速PCR檢測的需要，將所有的引物放在一個PCR反應(yīng)體系中，兩種引物PCR反應(yīng)的退火溫度都為51 ℃，這樣就可以實現(xiàn)毒株的同時擴增，既節(jié)約了試劑又節(jié)省了時間。

參考文獻：

[1] Kang M S, Jang H, Kim M C, et al. Development of a stabilizer for lyophilization of an attenuated duck viral hepatitis vaccine[J]. Poult Sci, 2010, 89(6):1 167-1 170.

[2] Wang Y, Li C, Chen Z, et al. Complete genome comparison of duck hepatitis virus type 1 parental and attenuated strains[J]. Virus Genes, 2012, 45(2):398-401.

[3] Fu Y, Chen Z, Li C, et al. Establishment of a duck cell line susceptible to duck hepatitis virus type 1[J]. J Virol Methods, 2012, 184(1-2):41-45.

[4] 付玉志, 張洪輝, 李傳峰, 等. I型鴨肝炎病毒在鴨胚成纖維細胞系中的增殖特性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2013,35(2):110-113.

[5] 袁率珍, 范書才，李 虹，等. 新型鴨肝炎病毒全基因組序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2010,32(7):507-511.

[6] Tseng C H, Knowles N J, Tsai H J. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus [J]. Virus Res, 2007, 123(2):190-203.

[7] Ding C, Zhang D. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J].Virology,2007,361 (1):9-17.

[8] Wang M, Zhang J, Zhou J H, et al. Analysis of codon usage in type 1 and the new genotypes of duck hepatitis virus[J].Biosystems, 2011,106(1):45-50.

[9] 范書才，李 虹，袁率珍, 等. 新型鴨肝炎病毒的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2009,31(10): 770-775.

[10] 趙金花, 沈志強, 朱 輝, 等. 新型鴨肝炎病毒的分離鑒定及VP1基因序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2011,33(10):772-780.

[11] 馬超英. 新型鴨肝炎病毒的分離鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2012,39 (12): 177-179.

[12] Gu C Q, Xie C Q, Hu X Y, et al. Cytokine gene expression in the livers of ducklings infected with duck hepatitis virus-1 JX strain[J]. Poult Sci, 2012, 91(3):583-591.

[13] 張艷芳, 羅 薇, 劉內(nèi)生, 等. 鴨肝炎病毒的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(7):171- 175.

[14] 苗立中, 謝金文,李 峰, 等. 鴨肝炎病毒分子生物學(xué)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展, 2012, 33(7):93-96.