徐州地區(qū) 9 株新城疫病毒的分離鑒定

李華坤

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 徐州 221006)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus, NDV)引起的雞和多種禽類的一種急性高度接觸性傳染病，強(qiáng)毒株感染易感禽常呈敗血癥癥狀，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血[1]。因毒株的致病性不同，表現(xiàn)為嚴(yán)重程度有很大差異的疾病。多年來，世界各地均采取積極的防治措施，但該病目前依然是我國乃至世界危害禽類最嚴(yán)重的疾病之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。徐州地區(qū)是江蘇省養(yǎng)禽業(yè)兩大聚集地之一，為了了解該地區(qū)ND的防治效果及流行現(xiàn)狀，2012年間，對(duì)家禽出現(xiàn)非正常死亡、臨床癥狀與病理變化疑似為新城疫的病例進(jìn)行病料采集、病毒的分離和鑒定，進(jìn)一步對(duì)毒株的致病性進(jìn)行了測(cè)定，為徐州地區(qū)的新城疫防治工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

在規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)和徐州附近的禽病門診收集疑似新城疫病例的病料，取腦、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟等主要臟器。

1.2 儀器與試劑

高速冷凍離心機(jī)(上海安亭公司)、恒溫金屬水浴鍋HHS-11-8型(常州諾基公司)、高壓滅菌鍋LDZX-50KBS(上海申安公司)、振蕩器、微量移液器(德國Eppendorf公司)、96孔“V”形血凝板。SPF雞胚購于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；抗新城疫、禽流感陽性血清由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供；含抗生素的磷酸鹽緩沖液(PBS)按文獻(xiàn)[2]的配方配制。所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 1% 紅細(xì)胞制備 用注射器抽取3.8% 枸櫞酸鈉溶液0.5 mL。采用無菌法抽取健康的未免疫雞的靜脈血4.5 mL，混勻后置15 mL 離心管，加生理鹽水適量，洗滌離心，共離心3次(第1、2次1 500 rpm, 5 min,第3次2 000 rpm, 5 min)洗去血清及白細(xì)胞。吸取紅細(xì)胞0.1 mL，加入9.9 mL生理鹽水，即成1%的雞紅細(xì)胞懸液。

1.3.2 病料處理 按照王偉偉[3]方法處理病料，用雙抗沖洗后，研碎，加入1∶4的生理鹽水，反復(fù)凍融3次后，3 000 rpm離心10 min，取上清備用。

1.3.3 病毒的分離培養(yǎng) 將病料上清無菌接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每份接種0.1 mL，置37 ℃培養(yǎng)，定期照蛋。將24～120 h內(nèi)死亡的死胚,120 h內(nèi)活胚置4 ℃冷卻4～24 h。無菌收獲尿囊液。做HA試驗(yàn)，如為陽性用已知抗NDV血清做HI試驗(yàn)，如為陰性再盲傳兩代。

1.3.4 血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)

1.3.4.1 血凝試驗(yàn)(HA) 96孔“V”型微量反應(yīng)板每孔滴加25 μL PBS；加25 μL收獲的尿囊液于左側(cè)第1孔，混勻，取25 μL至第2孔混勻，連續(xù)稀釋至第11孔，最后一孔留作陰性對(duì)照；各孔補(bǔ)加PBS 25 μL；各孔再加1%雞紅細(xì)胞25 μL，振蕩混勻，室溫或37 ℃溫箱作用，10 min開始觀察，直到結(jié)果出現(xiàn)。

1.3.4.2 血凝抑制試驗(yàn)(HI) 根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果，確定病毒的血凝價(jià)，配制4個(gè)單位病毒溶液。 96孔“V”型微量板從第1孔至第12孔各加入25 μL PBS；第1孔加新城疫陽性血清25 μL，均勻混合后，吸25 μL至第2孔充分混合，依次倍比稀釋至第10孔，棄25 μL稀釋的血清，11孔和12孔分別為陽性和陰性對(duì)照；自第1孔至11孔加入25 μL 4單位病毒液，第12孔補(bǔ)加25 μL PBS，混合均勻，置37 ℃溫箱作用10 min；各孔再加1%雞紅細(xì)胞25 μL；振蕩混勻，室溫或37 ℃溫箱作用10 min開始觀察，直到結(jié)果出現(xiàn)[4]。

1.3.5 1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)測(cè)定 按OIE標(biāo)準(zhǔn)提供的方法操作[5]，取HA滴度在24以上的尿囊液，用滅菌PBS 10倍稀釋后，腦內(nèi)接種于1日齡非免疫雞0.05 mL，每株接種10只[3,6-8]，在負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)，觀察10 d，死亡計(jì)2分，發(fā)病計(jì)1分，按照下列公式計(jì)算出相應(yīng)的數(shù)值。

ICPI=(8 d 內(nèi)累計(jì)死亡數(shù)×2+8 d 內(nèi)累計(jì)發(fā)病數(shù)×1)/8 d 內(nèi)累計(jì)觀察雞總數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與鑒定

無菌收集雞胚的尿囊液，分裝于EP管內(nèi)-70 ℃保存。通過對(duì)尿囊液進(jìn)行血凝及血凝抑制試驗(yàn)，證實(shí)所分離到的病毒具有血凝性，血凝價(jià)為26～28，未死的雞胚無血凝價(jià)。有血凝價(jià)的病毒能被新城疫陽性血清抑制，而不能被禽流感H5(Re-4、Re-5)和H9陽性血清抑制，因此所分離的病毒為新城疫病毒(見表1)，分別命名為PZ 03-2012、TS 03-2012、TS 01-2012、SN 03-2012、SN 12-2012、SN 05-2012、SN 01-2012、LB 05-2012、SN 04-2012。

2.2 1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)

分離毒株ICPI分別為0.21、0.28、0.35、1.89、2.48、1.81、2.85、1.98、2.11。9株NDV分離株中PZ 03-2012、TS 03-2012、TS 01-2012為弱毒株，SN 03-2012、SN 12-2012、SN 05-2012、SN 01-2012、LB05-2012、SN 04-2012為強(qiáng)毒株(表1)。

表1 新城疫病毒的鑒定Table 1 Identification of Newcastle disease viruses

3 討 論

ND是由NDV引起的雞的急性高度接觸性傳染病，強(qiáng)毒感染后常呈敗血癥經(jīng)過。由于致病的毒株不同及免疫狀態(tài)不同，所引起的臨床表現(xiàn)存在較大的差異。本研究中，HA和HI試驗(yàn)表明，在徐州地區(qū)確實(shí)存在新城疫病毒的感染，分析其原因主要是目前在國內(nèi)雞群中仍然頻繁使用新城疫Ⅳ系活疫苗，所以臨床上分離到新城疫病毒并不能確定說該禽群爆發(fā)了新城疫，必須結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化與分離毒株的致病性試驗(yàn)進(jìn)行綜合分析，才能準(zhǔn)確得出判斷。由于禽流感病毒感染也能引起類似的癥狀，在臨床上容易誤診，本地區(qū)是否存在禽流感病毒，還需要進(jìn)一步研究。

從我國家禽飼養(yǎng)模式看，國內(nèi)養(yǎng)殖水平參差不齊，造成我國高風(fēng)險(xiǎn)禽群分布較廣，對(duì)新城疫的防控形成挑戰(zhàn)[9]。這些高風(fēng)險(xiǎn)禽群主要為養(yǎng)殖模式落后的農(nóng)村散養(yǎng)戶或者是個(gè)體戶，養(yǎng)殖規(guī)模較小，甚至稱不上規(guī)模，普遍存在不使用疫苗免疫或免疫程序不合理的現(xiàn)象。一些規(guī)模化的養(yǎng)殖場(chǎng)，由于雞群中存在免疫抑制病[10]和免疫監(jiān)測(cè)不到位，即是免疫雞群仍有發(fā)生新城疫感染的可能。目前徐州地區(qū)的雞場(chǎng)大多數(shù)未實(shí)行全進(jìn)全出的飼養(yǎng)制度，有時(shí)雞場(chǎng)內(nèi)套養(yǎng)不同日齡的雞，在用I系中等毒力活疫苗對(duì)青年雞和成年雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫時(shí)，會(huì)造成同群飼養(yǎng)的幼雞發(fā)生新城疫感染[11]。本研究從臨床發(fā)病病例中分離到新城疫強(qiáng)毒，是與免疫抗體水平低下有關(guān)，還是與疫苗的抗原匹配性有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Alexander D J. Newcastle disease and other avian Paramyxoviridae infections[J].Disease of Poultry,edited by Calnek B W Iowa State University Press,1997.10:541-569.

[2] 薩姆布魯克J,拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.黃培堂，等，譯.北京: 科學(xué)出版社, 2008.

[3] 王偉偉.江蘇省新城疫病毒分子流行病學(xué)研究及鴿源分離株基因組序列的分析[D].江蘇揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2009.

[4] 楊漢春.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003:293-293.

[5] OIE.哺乳動(dòng)物、禽類和蜜蜂A類和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局，譯.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1996:140-146.

[6] 姚春峰.我國部分地區(qū)新城疫病毒的部分生物學(xué)特性鑒定及分子流行病學(xué)研究[D].江蘇揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué),2007.

[7] 姚春峰,劉文博,胡順林,等.新城疫病毒分離株的生物學(xué)特性鑒定及F蛋白基因序列分析[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2009,25(3):117-124.

[8] 譚偉成.新城疫病毒玉林株的分離鑒定與油乳劑滅活疫苗的研制[D].江蘇南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[9] 吳延功,丁國義,宋翠平,等.新城疫的流行特點(diǎn)與防控措施[J].中國家禽,2012,34(5): 5-7.

[10] 崔治中.雞群中免疫抑制性病毒的共感染及其相互作用-對(duì)新城疫和禽流感疫苗免疫反應(yīng)的抑制[J].中國動(dòng)物檢疫, 2007,24(10): 45-48.

[11] 孫 朋.新城疫流行現(xiàn)狀分析及綜合防控措施的建立[J].中國動(dòng)物檢疫，2011,28(12):79-81.