正常與乳腺腫瘤細(xì)胞表面黏附分子CD44活化狀態(tài)差異分析

侯利丹，劉鹥雯，何怡青，楊翠霞，杜 艷，高 鋒

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海200233)

CD44是一種廣泛分布于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體［1-2］。其配體透明質(zhì)酸(HA)是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的高分子黏多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。據(jù)報(bào)道，CD44與HA結(jié)合，可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附、淋巴細(xì)胞歸巢等多種生理和病理過程［3-4］。許多腫瘤細(xì)胞表面CD44高度表達(dá)，其在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。目前，已有許多學(xué)者以CD44為靶點(diǎn)分子，通過阻斷CD44-HA結(jié)合從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移，進(jìn)行腫瘤的靶向治療。Zawadzki等［5］運(yùn)用 CD44s受體蛋白、CD44v10受體蛋白和CD44單克隆抗體阻斷小鼠B16F10黑色素瘤CD44與其配體HA結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在不進(jìn)行任何其他處理的情況下，CD44s受體蛋白和CD44v10受體蛋白可使腫瘤在肺部的轉(zhuǎn)移量分別降低70%和60%，CD44單克隆抗體也取得了基本相同的效果。近年來，隨著納米載藥系統(tǒng)研究的興起，納米顆粒連接靶向分子HA，針對腫瘤細(xì)胞表面CD44進(jìn)行腫瘤靶向治療取得很大進(jìn)展。Auzenne等［6］發(fā)現(xiàn) HA-PTX納米顆粒對CD44陽性人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3ip和NMP-1的殺傷活性明顯大于單純PTX，加入過量游離的HA能夠阻斷這種增強(qiáng)的殺傷活性，提示HA-PTX通過靶向細(xì)胞表面CD44，達(dá)到增強(qiáng)殺傷細(xì)胞的效果。

雖然許多學(xué)者成功以CD44為靶點(diǎn)，HA為靶向分子，靶向殺傷腫瘤，提高藥物療效［7-8］。但是，關(guān)于以CD44為靶點(diǎn)靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，是否會靶向殺傷高表達(dá)CD44的正常細(xì)胞這一問題，少有報(bào)道。研究顯示CD44與HA的結(jié)合并不完全是自發(fā)的，不同活化狀態(tài)的CD44與HA的結(jié)合活性不同，與 CD44糖基化［9］、細(xì)胞類型［10］和 HA 自身狀態(tài)［11］等因素相關(guān)。許多腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞表面CD44處于活化狀態(tài)，不需要任何刺激因素即能自發(fā)結(jié)合HA［12］。正常細(xì)胞表面CD44處于何種狀態(tài)，是否存在上述調(diào)控，目前仍未闡明。我們通過檢測CD44與其天然配體HA的結(jié)合活性，探討正常細(xì)胞和乳腺腫瘤細(xì)胞表面CD44的活化狀態(tài)是否存在差異，旨在深入分析以HA為靶向分子，CD44為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤靶向治療的可行性，明確HA是否選擇性靶向腫瘤細(xì)胞表面CD44，而不靶向同樣高表達(dá)CD44的正常細(xì)胞。

材料和方法

一、細(xì)胞

乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549，正常小鼠胚細(xì)胞NIH3T3均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心;分離20名正常人肝素鈉抗凝血獲取其外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。

二、主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液均購自GIBCO公司，淋巴細(xì)胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，PE標(biāo)記的鼠抗人CD44單克隆抗體，PE標(biāo)記的鼠抗人CD44同型對照抗體均購自eBioscience公司，PE/Cy5標(biāo)記的鼠CD44單克隆抗體購自Abcam公司，熒光標(biāo)記的透明質(zhì)酸(FL-HA)購自Calbiochem公司。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

將Hs578T細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰島素)中常規(guī)培養(yǎng);BT-549細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、0.023 U/mL牛胰島素)中常規(guī)培養(yǎng);NIH3T3細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為5%CO2、37℃，飽和濕度。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均取自對數(shù)生長期。

四、Ficoll法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞

取正常人肝素鈉抗凝血4 mL，加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，將其緩慢加入適量淋巴細(xì)胞分離液中，800×g水平離心15 min，小心吸取白膜層，用PBS 400×g離心10 min洗滌2遍，即獲取人外周PBMCs。

五、流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面CD44的表達(dá)

分別取肝素鈉抗凝血100 μL，加入2個(gè)流式專用管中，實(shí)驗(yàn)組加入適量CD44-PE單克隆抗體，陰性對照加入等體積CD44-PE同型對照抗體，輕輕混勻，室溫避光孵育15～30 min后，在QPREP免疫學(xué)樣品制備儀(COULTER公司生產(chǎn))上處理血標(biāo)本，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。0.25%胰酶分別消化處于對數(shù)生長期的NIH3T3細(xì)胞、Hs578T細(xì)胞和BT-549細(xì)胞，顯微鏡下觀察。細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液時(shí)用含血清的培養(yǎng)液終止消化，200×g離心5min，棄上清，再用適量PBS洗滌2遍計(jì)數(shù)，所有細(xì)胞均按每管約106個(gè)細(xì)胞的比例，收集至2個(gè)Eppendorf管中。NIH3T3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組加入適量鼠CD44單克隆抗體，乳腺腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組加入適量鼠抗人CD44單克隆抗體，對照組加入等體積CD44同型對照抗體，室溫避光放置15～30 min，PBS 洗滌2 遍，500 μL PBS 重懸，移至流式管中上機(jī)檢測，收集10 000個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對數(shù)放大，結(jié)果用CD44細(xì)胞的陽性率表示，數(shù)據(jù)用軟件進(jìn)行分析。

六、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD44的活化狀態(tài)

用Ficoll法分離獲取2管人外周PBMCs，每管細(xì)胞數(shù)量約在106左右。0.25%胰酶分別消化處于對數(shù)生長期的小鼠胚細(xì)胞NIH3T3和乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549，顯微鏡下觀察。細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液時(shí)用含血清的培養(yǎng)液終止消化，200×g，離心5 min，棄上清，再用適量PBS洗滌2遍，PBS重懸后計(jì)數(shù)，所有細(xì)胞均按比例收集于2個(gè)Eppendorf管中，每管約106個(gè)細(xì)胞。每種細(xì)胞均分為實(shí)驗(yàn)管和對照管，實(shí)驗(yàn)管加入40 μg/mL FL-HA 100 μL 重懸，對照管加入100 μL 培養(yǎng)液，37℃避光孵育2 h。然后用PBS洗滌2遍，移至流式管中，上機(jī)檢測。

七、細(xì)胞免疫熒光法觀察FL-HA與細(xì)胞表面CD44的靶向結(jié)合作用

分別收集對數(shù)生長期的小鼠胚細(xì)胞NIH3T3和人乳腺腫瘤細(xì)胞 Hs578T、BT-549，消化至單細(xì)胞呈單個(gè)懸液，接種到24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24～48 h，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組設(shè)雙復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組加入 40 μg/mL FL-HA 200 μL，對照組加入200 μL培養(yǎng)液，37℃避光孵育1 h，PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表面CD44的表達(dá)

正常人 PBMCs、NIH3T3細(xì)胞及 Hs578T細(xì)胞、BT-549細(xì)胞均高表達(dá)CD44，見圖1。CD44細(xì)胞的陽性率分別為(99.57±0.31)%、(99.26±0.81)%、(99.85±0.21)% 和(99.99±0.10)%，各組間CD44表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

二、正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表面CD44的活化狀態(tài)

正常人 PBMCs、NIH3T3細(xì)胞表面 CD44與HA結(jié)合活性較低;乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549表面CD44與HA結(jié)合活性較高，CD44處于活化狀態(tài)，見圖2。CD44活化陽性率分別為(3.61±2.65)%、(14.33±1.35)%、(93.4±6.40)% 和(94.70 ±0.15)%，PBMCs、NIH3T3細(xì)胞與乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549表面CD44活化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示上述正常細(xì)胞表面CD44處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，乳腺腫瘤細(xì)胞表面CD44處于活化狀態(tài)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD44的表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD44的活化

三、FL-HA與細(xì)胞表面CD44的靶向結(jié)合

在熒光顯微鏡下觀察可見，與FL-HA孵育后，NIH3T3細(xì)胞與對照組熒光強(qiáng)度無明顯差異，表明FL-HA基本不與細(xì)胞表面CD44結(jié)合，無靶向作用，CD44處于相對靜止?fàn)顟B(tài);而乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549與對照組相比，細(xì)胞表面發(fā)呈現(xiàn)出強(qiáng)綠色熒光，提示FL-HA與腫瘤細(xì)胞表面CD44高度靶向結(jié)合，CD44處于活化狀態(tài)，見圖3。

圖3 細(xì)胞免疫熒光觀察FL-HA與細(xì)胞表面CD44結(jié)合活性

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，黏附分子CD44在許多惡性腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)腸癌等。其與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，特別是與天然配體HA的結(jié)合在腫瘤惡性進(jìn)展中的作用受到廣泛關(guān)注［13］。目前已有學(xué)者運(yùn)用HA、CD44單克隆抗體、CD44受體蛋白等阻斷CD44與HA的結(jié)合，有效減小腫瘤體積，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移;以HA為靶向分子制作的藥物通過結(jié)合靶點(diǎn)CD44有效地提高了藥物在腫瘤部位的聚集，增加藥物的生物利用度，達(dá)到靶向治療腫瘤的效果。盡管許多學(xué)者已將腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD44作為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤靶向治療研究，但在HA-化療藥靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面CD44，提高藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果的同時(shí)，機(jī)體許多正常細(xì)胞同樣高表達(dá)CD44，是否能夠免受靶向藥物的殺傷，及其如何免受其殺傷的機(jī)制，目前少有研究。

本研究分析了正常人PBMCs、NIH3T3細(xì)胞和乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549表面的CD44表達(dá)及其活化狀態(tài)——即其與HA的結(jié)合活性。首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述正常和腫瘤細(xì)胞表面CD44的表達(dá)水平，結(jié)果顯示正常人 PBMCs、NIH3T3細(xì)胞和乳腺腫瘤細(xì)胞Hs578T、BT-549均高表達(dá)CD44，陽性率在95%以上，驗(yàn)證了在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面CD44均存在高表達(dá)的現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用FL-HA通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44與HA的結(jié)合活性。結(jié)果顯示正常人PBMCs、NIH3T3細(xì)胞表面CD44與HA結(jié)合的活性較低，分別為(3.61±2.65)%和(14.33±1.35)%;乳腺腫瘤細(xì)胞表面CD44與HA的結(jié)合活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人PBMCs和NIH3T3細(xì)胞，均高于90%。正常與腫瘤細(xì)胞表面CD44與HA的結(jié)合活性存在相對差異。

本研究進(jìn)一步闡明了正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面CD44的活化狀態(tài)差異影響HA與其靶向結(jié)合的能力。NIH3T3細(xì)胞中加入FL-HA孵育后，熒光顯微鏡下觀察顯示NIH3T3基本無熒光，提示CD44處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，F(xiàn)L-HA與其靶向結(jié)合很弱。而腫瘤細(xì)胞表面呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光，提示乳腺腫瘤細(xì)胞表面CD44處于活化狀態(tài)，F(xiàn)L-HA與其有很強(qiáng)的靶向結(jié)合活性。這一現(xiàn)象說明以HA為靶向分子，以CD44為靶點(diǎn)制備抗腫瘤藥物，藥物能夠選擇性靶向高表達(dá)CD44的腫瘤細(xì)胞，有效提高藥物對腫瘤的殺傷作用，但同樣高表達(dá)CD44的正常細(xì)胞，由于CD44處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，與HA結(jié)合活性較低，藥物對其無靶向及殺傷作用。這一結(jié)果提示，HA在靶向殺傷高表達(dá)CD44的腫瘤細(xì)胞時(shí)，機(jī)體高表達(dá)CD44的正常組織可以免受其殺傷。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)了CD44分布于正常和腫瘤細(xì)胞上的活化狀態(tài)不同。以HA為靶向分子、CD44為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤靶向治療時(shí)，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞，有效避免靶向殺傷高表達(dá)CD44的正常細(xì)胞，為以CD44為靶點(diǎn)進(jìn)行的腫瘤靶向治療研究提供了新的依據(jù)。但本研究對CD44活化狀態(tài)的研究尚處于初級階段，所用細(xì)胞局限為乳腺腫瘤細(xì)胞，其他腫瘤尚未涉及，有待進(jìn)一步探索。另外，有關(guān)正常與腫瘤細(xì)胞表面不同活化狀態(tài)CD44的產(chǎn)生機(jī)制及其生物學(xué)意義，仍需進(jìn)一步深入研究。

［1］Orian-Rousseau V.CD44，a therapeutic target for metastasising tumours［J］.Eur J Cancer，2010，46(7):1271-1277.

［2］Toole BP，Slomiany MG.Hyaluronan，CD44 and Emmprin:partners in cancer cell chemoresistance［J］.Drug Resist Updat，2008 ，11(3):110-121.

［3］Coussens LM，Werb Z.Inflammatory cells and cancer:think different［J］.J Exp Med ，2001，193(6):F23-F26.

［4］Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44:from adhesion molecules to signalling regulators［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(1):33-45.

［5］Zawadzki V，Perschl A，R?sel M，et al.Blockade of metastasis formation by CD44-receptor globulin［J］.Int J Cancer，1998，75(6):919-924.

［6］Auzenne E，Ghosh SC，Khodadadian M，et al.Hyaluronic acid-paclitaxel:antitumor efficacy against CD44(+)human ovarian carcinoma xenografts［J］.Neoplasia，2007，9(6):479-486.

［7］Journo-Gershfeld G，Kapp D，Shamay Y，et al.Hyaluronan oligomers-HPMA copolymer conjugates for targeting paclitaxel to CD44-overexpressing ovarian carcinoma［J］.Pharm Res，2012，29(4):1121-1133.

［8］Cho HJ，Yoon IS，Yoon HY，et al.Polyethylene glycol-conjugated hyaluronic acid-ceramide selfassembled nanoparticles fortargeted delivery of doxorubicin［J］.Biomaterials，2012 ，33(4):1190-1200.

［9］Rodgers AK，Nair A，Binkley PA，et al.Inhibition of CD44 N- and O-linked glycosylation decreases endometrial cell lines attachment to peritoneal mesothelial cells［J］Fertil Steril，2011，95(2):823-825.

［10］Tzircotis G，Thorne RF，Isacke CM.Chemotaxis towards hyaluronan is dependent on CD44 expression and modulated by cell type variation in CD44-hyaluronan binding［J］.J Cell Sci，2005，118(Pt21):5119-5128.

［11］Lesley J，Gál I，Mahoney DJ，et al.TSG-6 modulates the interaction between hyaluronan and cell surface CD44［J］.J Biol Chem，2004，279(24):25745-25754.

［12］Richter U，Wicklein D，Geleff S，et al.The interaction between CD44 on tumor cells and hyaluronan under physiologic flow conditions:implications for metastasis formation［J］.Histochem Cell Biol，2012，137(5):687-695.

［13］Hanagiri T，Shinohara S，Takenaka M，et al.Effects of hyaluronic acid and CD44 interaction on the proliferation and invasiveness of malignant pleural mesothelioma［J］.Tumour Biol，2012，33(6):2135-2341.