ICU產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌氨基糖苷類修飾酶基因的分析

芮球紅，廖于峰，陳燕敏

(寧波市第二醫(yī)院檢驗科，浙江寧波315010)

大腸埃希菌是臨床常見的條件致病菌，也是重癥監(jiān)護病房(ICU)感染的主要病原菌之一。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌日益增多。ESBLs由質(zhì)粒介導，易在種屬甚至不同種屬細菌間傳遞造成暴發(fā)流行［1］。這一現(xiàn)象已成為醫(yī)院感染的突出問題。氨基糖苷類抗菌藥物(aminoglycosides，AGs)是一種治療革蘭陰性菌感染的重要抗菌藥物。細菌對該類藥物耐藥主要是通過產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶(AMEs)。我們收集了ICU分離的82株大腸埃希菌，通過ESBLs檢測、體外藥敏試驗和AMEs基因攜帶情況分析，了解ICU大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs感染發(fā)生率，探討產(chǎn)ESBLs株AGs耐藥和AMEs基因之間的關系，以期為臨床合理選用抗菌藥物提供理論依據(jù)。

一、材料和方法

1.菌株來源 82株大腸埃希菌臨床分離株(不含同一病例相同部位的重復分離株)來自寧波市第二醫(yī)院2011年1月至2012年7月期間ICU住院患者，其中痰標本20份、尿標本26份、分泌物標本21份、膿液標本11份、靜脈導管標本4份。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心)。

2.儀器與試劑 VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)、M-H瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購自法國 BioMerieux公司;藥敏紙片購自英國 Oxoid公司;5418型低溫離心機為Eppendorf公司產(chǎn)品;Power-PAC3000型電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;聚合酶鏈反應(PCR)試劑購自大連寶生物公司。

3.ESBLs表型確證試驗［2］參照美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的紙片確證擴散法標準進行，將頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸紙片貼在涂有待測菌的培養(yǎng)基上孵育，對2組中任何一個藥物加與不加克拉維酸的抑菌圈直徑差值≥5 mm時，可確證該菌株產(chǎn)ESBLs。

4.體外藥物敏感試驗 采用Kirby-Bauer紙片擴散法測定82株大腸埃希菌對6種AGs的敏感性。藥敏結果均按照2011年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準判定。

5.PCR檢測產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌AMEs基因 PCR擴增模板制備:挑純培養(yǎng)菌落少許置入0.5 mL離心管內(nèi)，加入200 μL雙蒸水，置100℃水浴10 min，12 000×g低溫離心30 s。上清液即為基因檢測的模板液。-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O計根據(jù) aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ和 ant(3")-Ⅰ基因序列并參照文獻［3］，由大連TakaRa公司合成，見表1。內(nèi)參照基因為GAPDH［5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(sense)，5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(antisense)］;擴 增 產(chǎn) 物 長 度 為452 bp。PCR 擴增體系:10×PCR Buffer 2.5 μL;2.5 mmol/L dNT 2.5 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μL;HS Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL;dH2O 16.8 μL;DNA(50 mg/L)2.0 μL;總體積為25.0 μL。反應條件:95℃預變性5 min;95℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán);最后 72℃延伸5 min。取 PCR擴增產(chǎn)物10 μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳。

6.統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢測結果 82株大腸埃希菌中檢出產(chǎn)ESBLs菌株43株，檢出率為52.4%。

2.產(chǎn)ESBLs菌株對AGs的耐藥特點 43株產(chǎn)ESBLs菌株有40株(90.7%)對AGs耐藥。產(chǎn)ESBLs和不產(chǎn)ESBLs菌株對6種AGs的耐藥率見表2。慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐藥率在產(chǎn)ESBLs和不產(chǎn)ESBLs菌株之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3.產(chǎn)ESBLs菌株大腸埃希菌AMEs基因攜帶情況 43株產(chǎn)ESBLs菌株中AMEs基因攜帶率為88.37%(38/43)，以 acc(3)-Ⅱ(79.07%)和 aac(6’)-Ⅰ(39.5%)為主，未檢出 aac(6’)-Ⅱ基因。產(chǎn)ESBLs菌株的acc(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ基因陽性率明顯高于不產(chǎn)ESBLs菌株(P＜0.05)。見表3。

表1 氨基糖苷類修飾酶基因引物序列

表2 產(chǎn)ESBLs與不產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌AGs耐藥情況比較［例(%)］

表3 產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌AMEs基因攜帶率比較［例(%)］

三、討論

ESBLs是一種絲氨酸酶衍生物，主要由腸桿菌科細菌產(chǎn)生，以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為代表。ESBLs基因由質(zhì)粒介導，可通過結合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導等形式進行耐藥性的傳播和擴散。因此，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌引起的耐藥問題給臨床治療帶來極大困難。本研究發(fā)現(xiàn)ICU大腸埃希菌ESBLs檢出率為52.4%，略高于文獻［4］報道。表明產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在本地區(qū)ICU流行嚴重，應引起足夠的重視。

AGs因其抗菌譜廣、療效卓越在治療革蘭氏陰性桿菌感染中得到廣泛的應用。近年來，由于抗生素泛用和過度治療，其耐藥性日趨嚴重。特別是產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺酶類嚴重耐藥的同時，對AGs耐藥性也明顯升高。本研究表明，本地區(qū)約90%的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對AGs耐藥，其中慶大霉素和鏈霉素的耐藥率約70%左右，而阿米卡星和奈替米星的耐藥率僅為10.7%左右。這可能與AGs的使用頻率、種類和ESBLs的基因型相關［5］。另外，與不產(chǎn) ESBLs大腸埃希菌相比，產(chǎn)ESBLs株慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素和妥布霉素耐藥率明顯增加(P＞0.05)。上述結果提示，本地區(qū)ICU醫(yī)生不能經(jīng)驗性的把AGs作為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌感染的治療藥物，必須嚴格按照體外藥敏結果來選用藥物。

大腸埃希菌對AGs耐藥的分子機制主要包括［6］:(1)藥物作用靶位的改變;(2)細菌細胞膜通透性改變，使進入胞內(nèi)的抗菌藥物減少;(3)產(chǎn)生AMEs;(4)細菌產(chǎn)生16SrRNA甲基化酶;(5)細菌通過主動外排機制將已進入胞內(nèi)的藥物泵至胞外。其中產(chǎn)生AMEs為主要原因。AMEs共價修飾抗菌藥物的氨基或羧基導致其結構變化，從而喪失與靶點結合的能力。AMEs主要有N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferases，AAC)、O-核苷轉(zhuǎn)移酶(O-nucleotidyltransferase，ANT)和 O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(O-phosphotransferases，APH)。目前研究較多的主要是AAC和ANT。本研究通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)，產(chǎn) ESBLs菌株 AMEs基因攜帶率高達88.37%。6種 AMEs基因中居前2位的是 acc(3)-Ⅱ(79.07%)和 aac(6’)-Ⅰ(39.5%)。本研究結果與黃永茂等［5］報道類似，但羅建華［7］等報道產(chǎn) ESBLs菌株 aac(3)-Ⅱ基因陽性率高達94.1%。原因可能是耐藥細菌質(zhì)粒介導的產(chǎn)ESBLs菌株具有區(qū)域特征性，不同區(qū)域有著不同的耐藥基因特征。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株acc(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ基因陽性率明顯高于不產(chǎn)ESBLs菌株。這與產(chǎn)ESBLs菌株AGs耐藥率高于不產(chǎn)ESBLs菌株相一致。腸桿科細菌酶基因常位于攜帶ESBLs基因的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上［8］。ESBLs以 SHV和 CTX-M 為主要基因型。Karisik等［9］發(fā)現(xiàn)攜帶CTX-M-15基因型的大腸埃希菌的質(zhì)粒上同時攜帶acc(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ。因此，本研究推測造成產(chǎn)與不產(chǎn)ESBLs菌株AMEs基因攜帶率差異的原因可能為產(chǎn)ESBLs基因的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子同時攜帶一個或多個AMEs基因，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用都有利于耐藥基因由耐藥菌向敏感菌傳播，導致多重耐藥。

總之，本地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對AGs耐藥性日趨嚴重，其機制可能為攜帶產(chǎn)ESBLs基因的質(zhì)粒同時攜帶AMEs基因。因此，深入了解質(zhì)粒介導的耐藥機制對研制新的有效的抗菌藥物非常必要。

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