佛波酯誘導(dǎo)血小板黏附受體GPⅠbα酶切的機(jī)制研究

王志成，羅梅宏，謝如鋒，張曉峰

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海200071;2.上海市血液中心血液工程室，上海200051)

血小板在活化的同時(shí)，伴隨有黏附受體GPⅠbα的酶切，產(chǎn)生的酶切片段稱(chēng)為糖盞蛋白(glycocalicin，GC)［1］。GPⅠbα 酶切是血小板儲(chǔ)存損傷(platelet storage lesion，PSL)一個(gè)重要的生物標(biāo)志物［2］。因此，闡明GPⅠbα酶切的機(jī)制將有助于認(rèn)識(shí)血小板儲(chǔ)存損傷的機(jī)理。

佛波酯 (phorbol12-myristate-13-acetate，PMA)是常用的蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)的活化劑。PMA 能誘導(dǎo) GPⅠbα 酶切［3］，但是PMA誘導(dǎo)GPⅠbα酶切的分子機(jī)制尚未完全闡明。我們主要探討了PMA誘導(dǎo)GPⅠbα酶切的分子機(jī)制。

材料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象 選取健康志愿者10名，男、女各5名，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)同意，志愿者均簽署知情同意書(shū)。

2.主要試劑 抗GPⅠbα N端單克隆抗體SZ-2、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司;GM6001購(gòu)自Calbiochem公司;二硫蘇糖醇(DTT)、NAD(P)H氧化酶抑制劑(DPI)、蛋白激酶 C(PKC)抑制劑(BIM)、佛波酯(PMA)、ROS檢測(cè)探針DCFDA購(gòu)自Sigma公司;PKC活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;線粒體活化氧(ROS)拮抗劑MitoQ購(gòu)自蘇州沃盛化學(xué)有限公司。

二、方法

1.制備洗滌血小板 取健康自愿者靜脈血，用檸檬酸鹽緩沖液(ACD)按照1∶7抗凝，380×g離心20 min得到富含血小板血漿(PRP)，PRP經(jīng)1 500×g離心20 min，沉淀用葡萄糖檸檬酸鹽緩沖液(CGS)緩沖液懸浮，經(jīng)離心、洗滌，最后用MTB液重懸，得到洗滌血小板，調(diào)整血小板濃度為3×108/mL，室溫靜置1 h使其恢復(fù)至靜息狀態(tài)以備用［4］。

2.Western blot檢測(cè) GPⅠbα酶切片段 3×108個(gè)/mL洗滌血小板與1.0 μmol/L PMA或二甲基亞礬(DMSO)37℃孵育30 min，2 600×g離心5 min，得到上清，加入5×上樣緩沖液和β-巰基乙醇，最后樣品經(jīng)western blot檢測(cè)GPⅠbα酶切片段。抑制實(shí)驗(yàn):3×108個(gè)/mL洗滌血小板預(yù)先與100 μmol/L BIM、DTT(25、50、100、200 μmol/L)或DMSO 37℃孵育15 min后，再與1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS 3×108個(gè)/mL洗滌血小板分別與不同濃度PMA(0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L)或 DMSO 37 ℃孵育 30 min，加 ROS檢測(cè)探針 DCFDA(20 μmol/L)孵育10 min，經(jīng)稀釋后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。抑制實(shí)驗(yàn):3×108個(gè)/mL洗滌血小板預(yù)先與 10 μmol/L DPI、100 μmol/L MitoQ、100 μmol/L BIM、200 μmol/L DTT或DMSO 37℃孵育15 min，再與1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。

4.檢測(cè)PKC活性 3×108個(gè)/mL洗滌血小板與1.0 μmol/L PMA或DMSO 37℃孵育30 min。抑制實(shí)驗(yàn):3×108個(gè)/mL洗滌血小板預(yù)先與200 μmol/L DTT、100 μmol/L BIM 或 DMSO 37 ℃孵育 15 min，再與 1.0 μmol/L PMA 37 ℃ 孵育30 min。使用非同位素標(biāo)記的PKC活性檢測(cè)試劑盒，先抽提PKC，再檢測(cè)。具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、BIM抑制 PMA誘導(dǎo)的 GPⅠbα酶切的分析

PMA是常用的PKC活化劑，能誘導(dǎo)GPⅠbα酶切。為了證實(shí)PKC在PMA誘導(dǎo)GPⅠbα酶切中的作用，本研究使用PKC特異性抑制劑BIM，同時(shí)使用解離素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)抑制劑GM6001作為對(duì)照。圖1結(jié)果顯示，BIM完全抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切;GM6001能完全抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切。

圖1 BIM完全抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切

二、DTT抑制 PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切的分析

ROS通過(guò)氧化ADAM17的半胱氨酸殘基調(diào)控ADAM17活性［5］。為了證實(shí) ROS是否參與PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切，本研究使用ROS抑制劑DTT。結(jié)果顯示DTT濃度依賴(lài)地抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα 酶切，在高濃度(200 μmol/L)時(shí)能完全抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切。表明ROS參與調(diào)控PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切。見(jiàn)圖2。

圖2 DTT濃度依賴(lài)地抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切

三、PMA濃度依賴(lài)地誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生ROS

為了證實(shí)PMA是否誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生ROS，本研究使用ROS檢測(cè)探針DCFDA。圖3結(jié)果顯示，PMA濃度依賴(lài)地誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生ROS，表明PMA能夠誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生ROS。

圖3 PMA濃度依賴(lài)地誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生ROS

四、NAD(P)H氧化酶抑制劑抑制PMA誘導(dǎo)的ROS

ROS主要由線粒體呼吸鏈和NAD(P)H氧化酶產(chǎn)生［6］。為了證實(shí)PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS的來(lái)源，本研究使用線粒體靶向的ROS拮抗劑MitoQ和DPI。圖4結(jié)果顯示，MitoQ不抑制PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，而DPI則抑制PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，表明PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS來(lái)自NAD(P)H氧化酶。

圖4 DPI抑制PMA誘導(dǎo)的ROS

五、PKC抑制劑抑制PMA誘導(dǎo)的ROS

為了證實(shí)PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS是通過(guò)活化PKC，本研究使用BIM。圖5結(jié)果顯示，BIM抑制PMA誘導(dǎo)的 ROS，表明PKC參與 PMA誘導(dǎo)的ROS，提示PKC可能在ROS信號(hào)通路的上游。

六、ROS抑制劑不抑制PMA誘導(dǎo)的PKC活化

為了進(jìn)一步證實(shí)PKC與ROS之間的上下游關(guān)系，本研究使用PKC活性檢測(cè)試劑盒。圖6結(jié)果顯示，DTT不影響PMA誘導(dǎo)的 PKC活性，而B(niǎo)IM則抑制PMA誘導(dǎo)的PKC活化。

圖5 BIM抑制PMA誘導(dǎo)的ROS

圖6 DTT不抑制PMA誘導(dǎo)的PKC活化

討 論

GPⅠbα是血小板膜受體GPIb-IX-V復(fù)合物中最重要的一個(gè)亞基，能與血管性血友病因子(VWF)、凝血酶、P-選擇素等結(jié)合，在血小板血栓形成的起始階段起關(guān)鍵作用［7］。血小板在活化的同時(shí)，伴隨有GPⅠbα酶切，產(chǎn)生的酶切片段稱(chēng)為 GC［1］。

最近Bergmeier等［8］使用基因敲除小鼠證實(shí)ADAM17是負(fù)責(zé)酶切 GPⅠbα的主要蛋白酶。ADAM17由824個(gè)氨基酸殘基組成的I型跨膜蛋白，含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域。從N端開(kāi)始包括:信號(hào)肽、前域、金屬蛋白酶域、解離素域、表皮生長(zhǎng)因子樣域、半胱氨酸富含域、跨膜域和胞質(zhì)尾［9］。已有報(bào)道，ADAM17的前域、半胱氨酸富含域、跨膜域和胞質(zhì)尾參與ADAM17的活性調(diào)節(jié)［10］。其中，胞質(zhì)尾在ADAM17活性調(diào)控中的調(diào)節(jié)存在爭(zhēng)議，有些報(bào)道認(rèn)為ADAM17胞質(zhì)尾的絲氨酸被p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)或PKC磷酸化引起ADAM17活性增加［11-12］;另一些報(bào)道認(rèn)為胞質(zhì)尾不參與調(diào)控ADAM17活性［13］。PMA是PKC活化劑，常用于ADAM17底物酶切的研究。Killock等［12］報(bào)道，PMA先活化PKC，活化的PKC直接磷酸化ADAM17胞質(zhì)尾的絲氨酸，進(jìn)而活化ADAM17引起底物的酶切。PMA能夠誘導(dǎo)GPⅠbα酶切已被很多文獻(xiàn)報(bào)道［3］。然而，PMA 誘導(dǎo) GPⅠbα酶切的信號(hào)通路目前還未完全闡明。本研究使用各種抑制劑，結(jié)果表明在PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切中，可能存在“PMA-PKC-NAD(P)H氧化酶-ROS-ADAM17-GPⅠbα酶切”信號(hào)通路。本研究進(jìn)一步支持ADAM17的胞質(zhì)尾可能不參與調(diào)節(jié)ADAM17活性。NAD(P)H氧化酶是由5個(gè)主要亞基構(gòu)成的酶復(fù)合體［14］。PKC如何引起NAD(P)H氧化酶活化本研究未涉及，可能通過(guò)直接或間接的方式，目前這方面的研究正在進(jìn)行中。

近年來(lái)，ROS在調(diào)控ADAM17活性方面逐漸引起人們的關(guān)注［5］。ROS的來(lái)源主要有線粒體呼吸鏈和NAD(P)H氧化酶。本研究結(jié)果顯示，PMA通過(guò)活化PKC，PKC通過(guò)直接或間接途徑活化NAD(P)H氧化酶，產(chǎn)生ROS，ROS通過(guò)直接或間接的方式活化ADAM17，進(jìn)而引起GPⅠbα酶切。有報(bào)道，ROS能直接通過(guò)氧化ADAM17的半胱氨酸殘基直接活化ADAM17［5］;也有報(bào)道，ROS通過(guò)活化p38MAPK進(jìn)而引起ADAM17的活化［15］。ROS如何引起ADAM17活化本研究未涉及，可能通過(guò)直接或間接的方式，目前這方面的研究正在進(jìn)行中。

最近的研究報(bào)道，鈣離子依賴(lài)蛋白酶(calpain)參與 A23187、凝血酶(在攪拌條件下)和calpain活化劑dibucaine誘導(dǎo)的GPⅠbα 酶切［16］。本研究使用calpain抑制劑MDL28170，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDL28170不抑制PMA誘導(dǎo)的GPⅠbα酶切，表明不同的誘導(dǎo)劑引起的GPⅠbα酶切涉及不同的信號(hào)通路。

綜上所述，本研究證實(shí)PMA誘導(dǎo)GPⅠbα酶切不是通過(guò)PKC直接活化 ADAM17，而是通過(guò)NAD(P)H氧化酶產(chǎn)生的ROS活化ADAM17。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)GPⅠbα酶切的機(jī)制。闡明GPⅠbα酶切的機(jī)制不僅有助于認(rèn)識(shí)血小板血栓形成的機(jī)理，而且為認(rèn)識(shí)血小板儲(chǔ)存損傷提供新的視角。

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