利用甲醛固定的陳舊組織制作常規(guī)HE切片方法探討

瞿智玲 倪 娟 陳多恩 王 曦 王國平

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所，武漢430030）

組織經(jīng)甲醛長期固定后，組織細(xì)胞的著色力明顯下降，而且由于甲醛的揮發(fā)效應(yīng)，隨著時(shí)間的推移，固定液中實(shí)際甲醛的濃度逐漸降低，甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常規(guī)固定時(shí)要求的4%的濃度，因而細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常。此外，由于甲醛在空氣中被氧化成甲酸，導(dǎo)致甲醛固定液呈酸性，組織長期處于酸性環(huán)境下，影響其著色，本文的目的在于探討經(jīng)甲醛長期浸泡后的組織制作常規(guī)HE切片的染色方法。

材料和方法

1.材料

4%甲醛固定二十余年的亞急性重型肝炎病變之肝臟；碳酸氫鈉；FFA固定液。

2.試劑配制

2.1 5.6%碳酸氫鈉

稱取56g碳酸氫鈉，溶于1000ml蒸餾水中，充分溶解備用。

2.2 FFA固定液

市售甲醛液10ml、冰醋酸5ml及95%酒精85ml室溫混勻。

3.實(shí)驗(yàn)分組及染色方法

取肝臟同一切面上多塊組織，編號(hào)后分別做不同處理。實(shí)驗(yàn)分組如下：

A組：將組織行常規(guī)脫水處理，制作切片（切片厚度4μm），常規(guī)脫蠟染色。

B組：將組織行常規(guī)脫水處理，制作切片（切片厚度4μm），脫蠟后，浸入5.6%碳酸氫鈉溶液過夜，充分水洗，常規(guī)HE染色。

C組：將組織浸入5.6%碳酸氫鈉處理24h后取出，流水沖洗，F(xiàn)FA固定液固定4－6h，常規(guī)脫水處理，制作切片，常規(guī)脫蠟染色。

D組：將組織浸入5.6%碳酸氫鈉處理48h后取出，流水沖洗，F(xiàn)FA固定液固定4－6h，常規(guī)脫水處理，制作切片，常規(guī)脫蠟染色。

E組：將組織浸入5.6%碳酸氫鈉處理24h后取出，流水沖洗，F(xiàn)FA固定液固定4－6h，常規(guī)脫水處理，制作切片，脫蠟后，再浸入5.6%碳酸氫鈉溶液過夜，充分水洗，常規(guī)HE染色。

F組：將組織浸入5.6%碳酸氫鈉處理48h后取出，流水沖洗，F(xiàn)FA固定液固定4－6h，常規(guī)脫水處理，制作切片，脫蠟后，浸入5.6%碳酸氫鈉溶液過夜，充分水洗，常規(guī)HE染色。

結(jié) 果

A組組織和切片未經(jīng)任何特殊處理，細(xì)胞著色不理想，肝細(xì)胞形狀偏肥大（圖1）。B組組織未經(jīng)任何特殊處理，切片脫蠟后經(jīng)5.6%碳酸氫鈉處理過夜，細(xì)胞著色有所改善，但仍不理想，且肝細(xì)胞形狀仍偏肥大（圖2）。

C組和D組組織經(jīng)5.6%碳酸氫鈉分別處理24和48h后，再用FFA固定后制作切片，肝細(xì)胞形狀趨于正常大小，著色有所改善（圖3和4）。

E組和F組組織經(jīng)5.6%碳酸氫鈉分別處理24h和48h后，再用FFA固定，制作的切片再經(jīng)5.6%碳酸氫鈉浸泡過夜，結(jié)果顯示肝細(xì)胞形狀基本正常，著色明顯改善（圖5和6）。

綜上所述，組織經(jīng)FFA處理后，肝細(xì)胞形態(tài)異常得到改善，趨于正常大小。切片經(jīng)5.6%碳酸氫鈉處理后，隨碳酸氫鈉的處理時(shí)間延長，細(xì)胞著色達(dá)到明顯改善。

圖1 A組，未經(jīng)任何特殊處理的肝臟組織?！?00圖2 B組，僅切片經(jīng)5.6%碳酸氫鈉處理過夜的肝臟組織。×200圖3 C組，組織經(jīng)5.6%碳酸氫鈉浸泡24h，切片未作任何特殊處理的肝臟組織?！?00圖4 D組，組織經(jīng)5.6%碳酸氫鈉浸泡48h，切片未作任何特殊處理的肝臟組織?！?00圖5 E組，組織經(jīng)5.6%碳酸氫鈉浸泡24h，切片也經(jīng)5.6%碳酸氫鈉 過夜處理的肝臟組織。×200圖6 F組，組織經(jīng)5.6%碳酸氫鈉浸泡48h，切片也經(jīng)5.6%碳酸氫鈉 過夜處理的肝臟組織?！?00Fig.1 Group A，Liver tissue without any treatment×200Fig.2 Group B，only setions treated with 5.6%Na HCO3 overnight×200Fig.3 Group C，only liver tissue treated with 5.6%Na HCO3 for 24h×200Fig.4 Group D，only liver tissue treated with 5.6%Na HCO3 for 48h×200Fig.5 Group E，tissue and sections treated with 5.6%Na HCO3 for 24 h and overnight respectively×200Fig.6 Group F，tissue and sections treated with 5.6%Na HCO3 for 48h and overnight respectively×200

討 論

組織切片由于各種原因，或者組織放置過久，或者切片保存不善，導(dǎo)致制作常規(guī)HE切片時(shí)著色不好。筆者曾將褪色的HE切片恢復(fù)顏色［2］，獲得較好的效果。在嘗試本實(shí)驗(yàn)初，筆者采用此法，結(jié)果染色效果不佳。分析原因，發(fā)現(xiàn)褪色切片因組織一次處理到位，組織本身不存在著色問題，所作的只需加強(qiáng)染色效果即可。而本實(shí)驗(yàn)中因整個(gè)肝組織浸泡于甲醛液中，本身固定不徹底，再加上浸泡的時(shí)間過久，長達(dá)三十年，甲醛被氧化成甲酸，造成固定液由中性變成酸性，致使按常規(guī)方法制作HE切片效果不佳。

本文采取5.6%碳酸氫鈉處理組織和切片，碳酸氫鈉可以中和甲醛被氧化后產(chǎn)生的甲酸的酸性作用，調(diào)節(jié)組織的p H值，使組織細(xì)胞處于能較好著色的環(huán)境中［1］。用FFA固定液再次固定組織及切片，該固定液中冰醋酸對(duì)細(xì)胞具有收縮作用，使經(jīng)酸性甲醛浸泡后變肥大的細(xì)胞在形態(tài)上趨于正常大小。結(jié)果顯示，上述設(shè)想達(dá)到預(yù)期效果，細(xì)胞形態(tài)、大小和著色均得到改善。

［1］王伯沄，李玉松，黃高昇等.病理學(xué)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，2000；117－121

［2］瞿智玲，倪娟，敖啟林等.陳舊褪色病理教學(xué)HE切片顏色恢復(fù)技術(shù)探討.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27（4）：433－434