甘草酸二銨脂質(zhì)配位體對非酒精性脂肪肝大鼠白細(xì)胞浸潤的影響

劉梅梅 王 齊 劉曉利 陳曉宇＊

（安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，合肥230601；1安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥230032）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver dieases，NAFLD）已經(jīng)成為一種累及世界范圍內(nèi)大量人群的全球性疾病，在總?cè)巳褐蠳AFLD的患病率已達(dá)約20%［1］。NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，但是炎癥細(xì)胞浸潤是NAFLD的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)［2，3］。炎癥反應(yīng)既可以引發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性、損傷，又會進(jìn)一步促進(jìn)氧化和纖維化的進(jìn)程，因此，抑制炎癥細(xì)胞浸潤在NAFLD治療中是非常關(guān)鍵的。甘草酸二銨脂質(zhì)配位體（diammonium glycyrrhizinate lipid ligand，DGLL，天晴甘平）是中藥甘草有效成分的第3代提取物，具有較強(qiáng)的抗炎和保護(hù)肝細(xì)胞膜以及改善肝功能的作用。以往的藥理實(shí)驗(yàn)證明，DGLL能減輕高脂飲食大鼠引起的肝損傷，降低血清ALT、AST、TC、TG含量，從而起到保護(hù)肝臟的作用［4］。我們近來的研究表明，DGLL對于治療高脂飼料誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪肝中肝臟組織及血清中炎癥因子TNF－α的釋放有明顯的抑制作用，這種抑制作用與其抑制NF－κB炎癥反應(yīng)系統(tǒng)的活化相關(guān)［5］。然而，DGLL對NAFLD過程中炎癥細(xì)胞的浸潤是否有抑制作用及其作用機(jī)制尚不清晰。本研究通過高脂飼料建立大鼠非酒精性脂肪肝模型，觀察DGLL對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中白細(xì)胞浸潤的影響及其內(nèi)在機(jī)制。

材料和方法

1.材料

1.1 藥品和試劑 DGLL腸溶膠囊，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司（批號：091205）。聯(lián)苯雙酯片（BDP），北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品（批號：090802）。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠MPO、ICAM－1多克隆一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購自Santa Cruz公司。FITC標(biāo)記的大鼠CD11b和CD18抗體購自BD Biosciences公司。

1.2 動物 Spague－Dawlay（SD）大鼠，雄性，體重180－200 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（皖醫(yī)實(shí)動準(zhǔn)第01號）。動物自由進(jìn)食，飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫18℃－22℃，常規(guī)飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要儀器 Leica熒光顯微鏡，德國Leica公司。722S分光光度儀，上海精密科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。超薄切片機(jī)，LKB－NOVA型，瑞典。醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司。PowerPac300型電泳儀，美國BIO－RAD公司。FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

2.方法

2.1 造模、分組與給藥 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分6組：正常對照組、模型組、DGLL（30、60、120mg／kg）組，陽 性 對 照 藥 BDP（200mg／kg）組［6，7］，每組10只。NAFLD模型的建立參照文獻(xiàn)方法［8］。正常組給予相應(yīng)溶媒，模型組及給藥組均給予高脂乳劑灌胃（10ml／kg）。高脂乳劑灌胃3周后，DGLL干預(yù)組在造模的同時(shí)每日灌胃給予相應(yīng)濃度DGLL或BDP 1次，正常組和模型組給予等量生理鹽水。每周稱重一次，相應(yīng)調(diào)整灌胃量。

2.2 樣本采集和處理 實(shí)驗(yàn)6周末禁食12h后股動脈取血，血液以肝素抗凝，用于測定外周血白細(xì)胞粘附分子的表達(dá)；放血處死動物，迅速取部分肝組織，用于檢測肝組織MPO的活性以及ICAM－1的蛋白表達(dá)。

2.3 MPO活性檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測肝臟組織中的 MPO活性，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 免疫組化染色 取部分受試動物同部位肝組織，置于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5μm連續(xù)切片，采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色：3%H2O2溶液處理，熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉，滴加大鼠MPO單克隆抗體一抗（濃度1∶200），4℃過夜，隔夜滴加生物素化養(yǎng)抗兔IgG二抗，37℃孵育20 min，再滴加試劑SABC，DAB顯色。

2.5 外周血粘附分子檢測 在抗凝缺血中加入FITC標(biāo)記的大鼠CD11b和CD18抗體（1μg／100μl全血），室溫避光孵育30 min。溶血素溶血，PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算單核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞表面CD11b和CD18的表達(dá)量，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度表示［9］。

2.6 Western blot分析 提取肝臟組織總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法檢測蛋白含量。用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測量樣品在595nm處的吸光度，計(jì)算各組肝組織總蛋白含量。采用Western blot法檢測肝組織中ICAM－1蛋白的表達(dá)。各組以30μg蛋白／泳道上樣，經(jīng)10%SDSPAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1hr，加入小鼠抗大鼠ICAM－1一抗（1∶1000，4℃，過夜）及抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2000）進(jìn)行雜交，ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，顯影于感光膠片上。另以β－actin作為內(nèi)參，于醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)上分析ICAM－1蛋白表達(dá)的相對含量。

結(jié) 果

1.DGLL對高脂乳劑誘導(dǎo)SD大鼠NASH模型肝臟組織MPO表達(dá)和活性的影響

免疫組化結(jié)果顯示，肝臟組織MPO蛋白陽性染色呈棕黃色（箭頭所示）。正常組大鼠幾乎沒有MPO蛋白表達(dá)，模型組MPO蛋白陽性細(xì)胞，比正常組細(xì)胞數(shù)明顯增多，染色加深。與NAFLD模型組比較，30、60、120 mg／kg DGLL 組 MPO 蛋白表達(dá)隨著劑量的增加而逐漸減弱，200mg／kg BDP組MPO蛋白在肝細(xì)胞中表達(dá)也減弱，結(jié)果見圖1。與免疫組化結(jié)果相似，相比于正常組，高脂模型組MPO活性同樣顯著升高，而DGLL劑量依賴性地抑制了肝臟組織中 MPO的活性（P＜0.05，圖2）。該結(jié)果表明DGLL可以抑制高脂飲食造成的非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中炎性細(xì)胞的活化和浸潤。

表1 大鼠外周血單核細(xì)胞粘附分子表達(dá)水平Table 1 The expression of adhesion molecules on rat monocytes

圖4 大鼠外周血粒細(xì)胞粘附分子CD11b和CD18峰值圖。Fig.4 Histograms of adhesion molecules CD11b and CD18 expressed on rat neutrophils.

表2 大鼠外周血單核細(xì)胞粘附分子表達(dá)水平Table 2 The expression of adhesion molecules on rat neuthophils

3.DGLL對高脂乳劑誘導(dǎo)SD大鼠NASH模型肝臟組織中內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響

圖5A為Western blotting檢測肝組織中ICAM－1蛋白表達(dá)的結(jié)果。以β－actin為內(nèi)參照，將每組3例樣本目的條帶光密度掃描進(jìn)行半定量分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5B。相比于正常對照組，高脂模型組ICAM－1的蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），DGLL治療組劑量依存性的顯著下調(diào)了ICAM－1的蛋白表達(dá)（P＜0.05），BDP組ICAM－1的蛋白表達(dá)同樣較高脂模型組顯著降低（P＜0.05）。

圖5 大鼠肝臟組織ICAM－1蛋白的表達(dá)。與正常組相比＊P＜0.05；＃與模型組相比＃P＜0.05。Fig.5 The expression of ICAM－1 in rat hepatic tissues.＊P＜0.05 vs.control group；＃P＜0.05 vs.model group.

討 論

流行病學(xué)調(diào)查表明，NAFLD患病率趨于超越病毒性肝炎和酒精性肝病，已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題和社會問題。在NAFLD發(fā)病過程中，肝臟組織中炎性介質(zhì)的釋放和炎性細(xì)胞的浸潤是關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)。大量的臨床試驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)表明，在NAFLD病人及動物模型中，IL－6、IL－18、C反應(yīng)蛋白以及 TNF－α等炎性介質(zhì)均明顯增加［5，10］，由此引發(fā)的炎性細(xì)胞（如白細(xì)胞）的活化以及向肝臟組織的浸潤是NAFLD過程中炎癥反應(yīng)加重，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟細(xì)胞損傷以及纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11，12］。我們以往的研究表明，DGLL對于NAFLD大鼠模型中肝臟組織及血清中的炎癥因子如TNF－α的釋放有明顯的抑制作用，然而其對白細(xì)胞的活化以及組織浸潤的過程是否有改善作用尚未見報(bào)道。組織中MPO的表達(dá)和活性是白細(xì)胞的活化以及組織浸潤的標(biāo)志物，本研究采用免疫組織化學(xué)的方法，證明了DGLL可以抑制高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD中MPO在肝臟組織的表達(dá)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還用ELISA的方法定量的檢測了肝臟組織中MPO的活性，與免疫組織化學(xué)的結(jié)果一致，DGLL顯著地下調(diào)了NAFLD大鼠肝臟組織中的MPO的活性。綜合以上的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)首次證明了DGLL可以抑制高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD過程中白細(xì)胞的活化以及向肝臟組織的浸潤。這為其在臨床中治療NAFLD提供了新的理論依據(jù)。

在NAFLD早期病理過程中，肝臟中的Kuffer細(xì)胞被激活，釋放出包括TNF－α在內(nèi)的多種炎性因子［13］，同時(shí)，NAFLD 病理過程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放顯著增加，這些炎性介質(zhì)以及ROS均可以通過與白細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，上調(diào)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)［14］，增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，而白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是白細(xì)胞活化進(jìn)而向組織浸潤的初始環(huán)節(jié)。在白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附過程中，白細(xì)胞表面的粘附分子CD11b／CD18及其配體內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子ICAM－1的相互作用起著關(guān)鍵的作用［15］。本研究中，我們采用流式細(xì)胞技術(shù)定量的檢測了NAFLD大鼠外周血中單核細(xì)胞以及粒細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)，結(jié)果顯示模型組中單核細(xì)胞以及粒細(xì)胞表面粘附分子CD11b和CD18的表達(dá)均有顯著地升高，而采用DGLL對高脂誘導(dǎo)大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果顯示DGLL可劑量依賴性的顯著抑制NAFLD大鼠外周血白細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。同時(shí)，本研究還采用 Western blot的方法證實(shí)了NAFLD大鼠肝臟組織中的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子ICAM－1的水平顯著升高，DGLL干預(yù)組同樣可以劑量依賴性的抑制內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的水平，提示DGLL是通過抑制NAFLD大鼠外周血白細(xì)胞以及肝臟血管表面粘附分子的表達(dá)而抑制了白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而進(jìn)一步抑制了白細(xì)胞的活化以及向組織的浸潤過程。我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)DGLL可以抑制高脂導(dǎo)致的肝臟SOD活性的降低并減少肝臟MDA含量、抑制NAFLD大鼠肝線粒體損傷和肝微粒體CYP2E1的過度表達(dá)，從而抑制ROS的過量產(chǎn)生以及DGLL可以抑制NAFLD大鼠 TNF－α的釋放以及 NF－κB信號系統(tǒng)的活化［5］，因此，DGLL抑制粘附分子表達(dá)的作用可能與其抑制NAFLD大鼠過氧化物的產(chǎn)生以及炎癥信號通路的作用相關(guān)。

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