大同盆地高砷地下水中可培養(yǎng)耐砷微生物的群落結(jié)構(gòu)

許珊，蘇春利，馮亮，王焰新

中國地質(zhì)大學(xué)(武漢) 環(huán)境學(xué)院 生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點實驗室，武漢430074

長時期飲用高砷污染水，可引起包含皮膚損傷以及多個器官出現(xiàn)癌變的慢性中毒疾病[1]。目前，砷中毒已成為全人類共同面對的世界性難題，正威脅著至少22 個國家和地區(qū)5 000 萬人口的健康[2]。其中，以孟加拉、印度和中國最為嚴(yán)重[3]。砷中毒嚴(yán)重威脅著廣大高砷地下水分布區(qū)數(shù)百萬人群的生命，危害當(dāng)?shù)鼐用裆眢w健康，成為我國廣大農(nóng)村面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。

近年來，自然界中與砷代謝有關(guān)的微生物及其在地下水砷污染形成過程中的重要作用成為新的研究熱點。研究顯示，自然界中，砷代謝微生物廣泛參與了砷的生物地球化學(xué)循環(huán)，不但影響著現(xiàn)在環(huán)境中砷的地球化學(xué)行為，而且對早期地球環(huán)境的形成也具有一定作用。越來越多的證據(jù)表明，微生物對砷的遷移具有一定影響，如微生物活動促進(jìn)蓄水層中的砷從固相轉(zhuǎn)化為液相[4]。另外，細(xì)菌對砷的氧化還原作用以及吸附-解吸作用在地下水中的砷遷移過程中起著關(guān)鍵作用[4-9]。在天然環(huán)境中，微生物-有機(jī)體對As(III)氧化和As(V)還原的速率也具有很大影響，其作用可能是非生物條件的幾個數(shù)量級。一些天然有機(jī)物可將As(V)還原為As(Ⅲ)，還有一些可將As(Ⅲ)氧化為As(V)[10]。某些微生物在自然界中可長期與砷共存，并形成了不同的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制，包括As(V)和As(III)之間的氧化還原作用和砷的甲基化[4]。

國內(nèi)外研究主要是利用富集培養(yǎng)、PCR 和克隆測序從不同環(huán)境中分離研究耐砷菌，對分離菌株生長條件因素(包括環(huán)境要求、營養(yǎng)配置要求和生長狀況特性要求等)進(jìn)行更深入研究并探討其氧化或還原的特性。目前已從不同環(huán)境，包括礦山、土壤和沉積物、水相、鹽湖等環(huán)境中分離出了與砷行為相關(guān)的耐砷菌[11-14]，如Campos 等[15]從巖石中分離出耐砷菌，通過氧化還原實驗證明微生物在砷和類金屬固定過程中作用明顯。Drewniak 等[16]通過氧化/還原實驗發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)對砷污染地下水有顯著影響，并通過擴(kuò)增出亞砷酸鹽氧化基因和異化砷還原基因進(jìn)一步強(qiáng)化氧化或還原菌作用，同時也證明微生物也可利用其他化合物參與環(huán)境中砷的地球化學(xué)行為。

大同盆地是典型的高砷地下水區(qū)域，砷的濃度變化范圍為0.6 ～1 820 μg·L-1[17]。目前，對砷的行為研究大多是從水文地球化學(xué)方面探討高砷地下水的分布、賦存環(huán)境、砷的來源及形成機(jī)制[18-19]，而對富砷含水層沉積物中耐砷菌的分離研究較少。Duan 等[20]利用大同盆地沉積物中分離出的菌株進(jìn)行微生物實驗發(fā)現(xiàn)，微生物作用下地下水中的砷濃度明顯高于非生物作用下的砷濃度。Xie 等[21]從盆地高砷含水層中分離出一株具砷抗性和富集能力的Bacillus cercus菌，發(fā)現(xiàn)微生物活動會促進(jìn)沉積物中的砷地下水釋放。總體來看，對大同盆地高砷地下水環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)特征和優(yōu)勢種群的分布還缺乏深入研究，尤其是水相中微生物研究還沒有系統(tǒng)的開展。本文采用稀釋培養(yǎng)法研究了外加砷源對地下水中微生物數(shù)量的影響，同時基于生物學(xué)可培養(yǎng)方法，從高砷水樣中分離出耐砷菌，利用RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫對可培養(yǎng)菌進(jìn)行細(xì)菌分類以及16S rDNA 序列比對方法鑒定其種屬，為高砷地下水的生物修復(fù)找到關(guān)鍵菌株提供有效的信息。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 研究區(qū)概況

大同盆地是山西地塹系統(tǒng)的新生代斷陷盆地之一[22]，面積達(dá)6 000 km2，是典型的位于干旱-半干旱區(qū)的第4 系沉積盆地。年均降雨量225 mm 至400 mm，且主要集中在7—8 月份，平均蒸發(fā)量在2 000 mm 以上。

盆地周圍基石主要分布在盆地北部，西部和東部。北部出露有太古宙片麻巖和玄武巖，西部出露有寒武-奧陶系灰?guī)r和石炭-二疊-侏羅紀(jì)砂巖、頁巖，東北部零星分布有太古宙片麻巖和花崗巖[23]。盆地形成在古近紀(jì)以后，從山前傾斜平原到盆地中心沉積了厚度不等的第4 系松散巖類。桑干河是該盆地主干河流，發(fā)源于盆地西南寧武縣的管涔山，由西南向東北貫穿整個盆地。高砷地下水呈條帶狀分布于盆地中南部，從朔州市東部穿越山陰縣至應(yīng)縣，在寬約6 km，長約90 km 的范圍內(nèi)形成地下水砷富集帶[22]，縱向上主要分布在15 ～60 m 深的范圍內(nèi)。水化學(xué)類型以Na-HCO3型為主，pH 值呈弱堿性。部分飲用井水呈淡黃綠色，含有H2S 或CH4氣體，指示了該區(qū)典型的還原性地下水環(huán)境。

1.2 樣品采集與分析

2012 年7 月至9 月在盆地中部山陰縣古城、蘆嶺村、王莊、前射躲和雙寨飲用水井中分別采集地下水樣SHY-12-1、SHY-12-3、SHY-12-4、SHY-12-5 和DB12086，從小疙瘩村采集水樣C1-1 和D1-3。水樣SHY-12-3、SHY-12-4、SHY-12-5 以及D1-3 主要用于研究外加砷源對微生物數(shù)量的影響。水樣DB12086、C1-1 以及SHY-12-1 用于分離培養(yǎng)耐砷菌。采樣所用的水樣容器為500 mL 的聚乙烯瓶。取樣瓶在采樣前先用蒸餾水清洗，再在采樣時用預(yù)采水樣潤洗3 次。水溫、pH 及電導(dǎo)率等水質(zhì)參數(shù)在現(xiàn)場進(jìn)行測定，堿度采用滴定法在24 h 內(nèi)測定，一個子樣用0.45 μm 濾膜過濾后加入HNO3保存，采用IRIS INTRE ⅡXSP 型ICP-AES(美國Thermo Electron 公司)測定金屬元素，另一個子樣采用DX-120 型離子色譜儀(美國DIONEX 公司)進(jìn)行測定。元素As 含量采用AFS-2202 型雙道原子熒光光度計(北京吉天有限公司)進(jìn)行測定。剩余的子樣送回實驗室后，一個子樣用無菌的0.22 μm 孔徑膜過濾用于提取總DNA 和富集培養(yǎng)，另一個用于稀釋培養(yǎng)。

1.3 稀釋培養(yǎng)

分別取10 μL SHY-12-3、SHY-12-4、SHY-12-5、D1-3 水樣至90 μL 無菌水中混勻。然后，取100 μL混合液至含0、375、3 750、11 250 和37 500 μg·L-1As(III)的LB 固體培養(yǎng)基平板上涂抹均勻。每次涂抹時需先將涂布棒灼燒滅菌，將涂抹好的平板倒置放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出菌落之后進(jìn)行計數(shù)。同樣取100 μL 水樣，涂布于含0、375、3 750、11 250 和37 500 μg·L-1As(III)的LB 固體培養(yǎng)基，每個樣重復(fù)3 次。

1.4 耐砷菌分離

C1-1 和SHY-12-1 樣品采集送回實驗室后，立即用無菌的0.22 μm 孔徑膜過濾，將過濾膜含微生物的一面朝下放入150 mg·L-1As(III)的耐砷固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方:每升雙蒸水中含2.0 g NH4NO3、2.0 g 無水乙酸鈉、0.5 g 酵母提取物、1.0 g胰蛋白胨、0.2 g 葡萄糖和15 g 瓊脂，pH 值7.5，滅菌后加入無菌NaAsO2至As(III)終濃度150 mg·L-1，37℃避光培養(yǎng)。然后將長出來菌落根據(jù)形態(tài)上不同的克隆子再次劃線培養(yǎng)后，再根據(jù)克隆子顏色，大小，形狀，細(xì)胞形態(tài)和基本細(xì)胞壁性能(革蘭氏染色)的差異挑選有代表性的菌株。

DB12086 樣品采集送回實驗室后，立即用無菌的0.22 μm 孔徑膜過濾，將過濾膜含微生物的一面朝下放入含37 500 μg·L-1As(III)的LB 固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方:每升雙蒸水中含10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母粉、10 g 氯化鈉和15 g 瓊脂粉，pH 值7.5，滅菌后加入無菌NaAsO2至As(III)終濃度37 500 μg·L-1，37℃避光培養(yǎng)。然后將長出來菌落根據(jù)形態(tài)上不同的克隆子再次劃線培養(yǎng)后，再根據(jù)克隆子顏色，大小，形狀，細(xì)胞形態(tài)的差異挑選有代表性的菌株。

1.5 耐砷菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

挑選出的單菌落根據(jù)微生物PCR 直接裂解緩沖液(Lysis Buffer for microorganism to Direct PCR，Takara)試劑說明書方法經(jīng)裂解、PCR 擴(kuò)增、電泳鑒定后，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。RDP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)菌分類分析(http://rdp.cme.msu.edu/)，得到群落結(jié)構(gòu)大致分類結(jié)果。用NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blast 搜索所得序列的同源性序列，進(jìn)一步確定細(xì)菌種類，用Mega 4.0 采用鄰接法(neighbor-joinin,N-J)對細(xì)菌群落構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 水化學(xué)特征

7 個地下水樣的溫度變化范圍為9.0 ～12.3℃，pH 值為7.43 ～8.80，呈弱堿性，總?cè)芙夤腆w(TDS)含量為564.7 ～4 843 mg·L-1，屬Na-HCO3型微咸水。As 含量變化范圍為7.25 ～528 μg·L-1，除了樣品SHY-12-4 砷含量較低外，其余6 個水樣均超過了世界衛(wèi)生組織規(guī)定的飲用水標(biāo)準(zhǔn)上限(10 μg·L-1)，具體水化學(xué)成分見表1。其中，砷含量極高的水樣DB12086、D1-3、SHY-12-1 的氧化還原電位(ORP)均為較高的負(fù)值，表明高砷地下水處于較強(qiáng)的還原環(huán)境。

2.2 外加砷源對不同類型微生物數(shù)量的影響

不同外加NaAsO2濃度下微生物計數(shù)結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著外加砷源濃度不斷升高，地下水中微生物量呈現(xiàn)一個波動的變化過程，初始加入外加砷源為375 μg·L-1As(III)時，微生物數(shù)量都明顯減少，推測該現(xiàn)象的原因是As 對大部分微生物生長不利，使培養(yǎng)基中不適應(yīng)條件的微生物大量死亡。但當(dāng)As 濃度達(dá)到3 750 μg·L-1時，培養(yǎng)基中微生物數(shù)量均出現(xiàn)小幅度回升，表明低濃度的砷對微生物生長可能具有刺激作用。當(dāng)加入外加砷源濃度達(dá)到11 250 μg·L-1時，所有樣品的微生物量都有降低。當(dāng)外加砷源濃度達(dá)到37 500 μg·L-1時，樣品SHY-12-3 的微生物量繼續(xù)降低，D1-3 出現(xiàn)微生物量急劇減少現(xiàn)象，而SHY-12-4 和SHY-12-5 樣中微生物量則回升。推測可能是因為砷對微生物有兩種效應(yīng):一是不適應(yīng)砷的微生物類群數(shù)量的減少，二是耐砷微生物的數(shù)量增大。D1-3 土著微生物處于強(qiáng)還原環(huán)境，生存的主要是厭氧菌，只有少量兼性厭氧菌，因此有氧培養(yǎng)時，厭氧菌死亡，而只有少量兼性厭氧菌生存。當(dāng)?shù)蜐舛萅aAsO2培養(yǎng)時適應(yīng)砷的微生物數(shù)量增加，但外加砷濃度高達(dá)37 500 μg·L-1As(III)時，已超過微生物原位環(huán)境的砷濃度(497.50 μg·L-1)近75 倍，大量兼性菌死亡。處于氧化環(huán)境的SHY-12-4、SHY-12-5 中生存的微生物主要是氧化菌，高濃度砷條件下生存物種可能比較單一，但砷很可能成為了某些抗砷菌生長所必需的元素，因而微生物數(shù)量會有增加，但相對未加NaAsO2的空白培養(yǎng)基，添加砷源條件下微生物數(shù)量還是有所減少。由此推測，總體上砷對環(huán)境中微生物生長具有一定的抑制作用，影響程度受水化學(xué)環(huán)境和水化學(xué)性質(zhì)影響。

表1 大同盆地高砷地下水的水化學(xué)特征Table 1 Hydrochemical characteristics of arsenic-rich groundwater from Datong Basin

圖1 不同砷濃度培養(yǎng)條件下水中微生物的數(shù)量Fig.1 Microorganism population in aqueous medium with different arsenic concentrations

熊如意[24]的研究表明，土壤中的砷會對自養(yǎng)微生物形成抑制和毒害作用，低濃度砷對異養(yǎng)微生物有刺激生長作用，高濃度砷對異養(yǎng)微生物有抑制作用，并且外加砷源對微生物生態(tài)的影響也很明顯，與本研究結(jié)果比較符合。本實驗中添加的砷源是毒性較大的NaAsO2，效果比較明顯，具有一定借鑒意義。砷對微生物數(shù)量的影響，必然會導(dǎo)致其對種群結(jié)構(gòu)的影響，微生物種類不同其功能也有不同，因而會直接影響到各種微生物不同功能的發(fā)揮以及其相互作用，從而對有機(jī)物的分解利用，營養(yǎng)元素循環(huán)等作用產(chǎn)生影響，最終對砷的循環(huán)遷移產(chǎn)生影響。

2.3 耐砷菌的群落結(jié)構(gòu)特征

由RDP 分析及Blast 分析得到高砷地下水中可培養(yǎng)細(xì)菌組成如圖2 所示。地下水中分離菌株鑒定及16S rDNA 基因系統(tǒng)發(fā)育圖見圖3。

圖2 大同盆地高砷地下水中可培養(yǎng)細(xì)菌的組成注:DB12086 樣品分離菌的耐砷濃度為37 500 μg·L-1，C1-1 和SHY-12-1 樣品分離菌的耐砷濃度為150 mg·L-1。Fig.2 Compositions of the cultivable bacteria from high arsenic groundwater in Datong Basin

從水樣DB12086 中分離出耐高濃度砷(37 500 μg·L-1)的菌株共45 株，分屬4 種不同目:假單胞菌目(Pseudomonadales 87%)、氣單胞菌目(Aeromonadales 7%)、芽孢桿菌目(Bacillales 4%)和未分類桿菌綱(unclassified Bacilli 2%)，其中部分可細(xì)分到假單胞菌屬(Pseudomonas 39 株)以及氣單胞菌屬(Aeromonas 3 株)?？梢姀拇它c分離出大部分菌株屬于革蘭氏陰性的異養(yǎng)的變形菌門(Proteobacteria)，且主要是γ-Proteobacteria。從C1-1 號樣品分離出耐150 mg·L-1砷濃度的菌株共有11 株，分屬芽孢桿菌屬(Bacillus 64%)、假單胞菌屬(Pseudomonas 9%)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus 27%)。從SHY-12-1 號樣品分離出9 株菌，其中大部分是芽孢桿菌屬Bacillus(6 株)，另外的則屬腸桿菌屬(Enterobacter)。這兩個地方都分離出芽孢桿菌(Bacillus)，此類菌屬革蘭氏陽性菌，在環(huán)境中廣泛存在，能夠形成芽孢，具有很強(qiáng)的抵抗逆境能力，在干燥狀態(tài)下可生存數(shù)十年。不過微生物活性、存在及其生長會受到如溫度、pH、氧化還原電位等水化學(xué)因素的影響，因而不同深度含水層和不同成因的地下水中細(xì)菌的數(shù)量和種類會有差別。Fan 等[25]研究發(fā)現(xiàn)砷氧化菌主要分布在沉積物淺表層，而砷還原菌主要分布在沉積物中深層。本實驗3 個點地下水溫度適中、pH 呈弱堿性，適合大部分地下水中的微生物生長。3 個地下水樣的As 濃度都偏高，對大部分微生物生長可能都是不利的，生存物種可能比較單一，但也會使得微生物在這一獨特的極端環(huán)境中經(jīng)過長期的變異與進(jìn)化產(chǎn)生抗砷的特性。原位水處于氧化環(huán)境、砷濃度為104 μg·L-1的C1-1 與原位水處于還原環(huán)境、砷濃度高達(dá)528 μg·L-1的SHY-12-1 相比，從C1-1 分離出特有屬是Pseudomonas 和Paenibacillus，這類微生物大部分是需氧菌，從SHY-12-1 分離出特有屬是兼性厭氧的Enterobacter，是一類γ-Proteobacteria 細(xì)菌。DB12086 可培養(yǎng)微生物種類主要是Pseudomonas，也是一類γ-Proteobacteria菌，與同樣還原條件的SHY-12-1 比較，Enterobacter 耐As(III) 性較Pseudomonas 可能更強(qiáng)。Taylor 等[26]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境主要耐砷微生物屬于γ-Proteobacteria 和δ-Proteobacteria，本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實，大同盆地高砷地下水中γ-Proteobacteria 細(xì)菌是環(huán)境中主要耐砷微生物。

由圖3 知，從DB12086 號樣品分離出的菌株DB12086-1 等 屬 Pseudomonas。與 從 冰 川(JX949976.1)、煙葉草(FJ815158.1)和阿爾塔米拉(Altamira)洞穴(FJ790133)環(huán)境中分離出的菌株相似性最高。Pseudomonas 代謝多樣，在自然界甚至是一些極端環(huán)境條件下也廣泛分布，因而在研究區(qū)地下水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)此類菌存在并不奇怪。FJ790133 菌株在15℃培養(yǎng)時可使培養(yǎng)基中的pH 值從7.0 升到9.3[27],而pH 值的增大會使膠體和粘土礦物表面帶更多的負(fù)電荷,從而降低對以陰離子形式存在的砷酸和亞砷酸的吸附，這是造成砷濃度增大的一個重要因素[23]。因此可推測分離出的菌株P(guān)seudomonas可能通過改變地下水的水化學(xué)特征(如使pH 值升高)，從而促進(jìn)高砷地下水的形成。分離出的DB12086-27 菌株與從水源、土壤以及人的糞便都已分離出的Aeromonas 相似性達(dá)99%，Anderson等[28]從新西蘭(New Zealand)尾礦中就分離到一株Aeromonas sp.CA1 菌株，該菌可通過一種迄今未報道的機(jī)制將砷酸鹽還原為亞砷酸鹽，同時發(fā)現(xiàn)pH值的升高能延長分離菌的生長周期。Wang 等[29]從水稻土壤中分離出可還原Fe(Ⅲ)的Aeromonas，說明還原菌株具有較強(qiáng)的還原Fe 的能力。本研究結(jié)果與這些研究者從其他環(huán)境中分離出的耐砷菌株的結(jié)果是相符，如Pepi 等[30]從砷污染的奧巴蒂羅市(Orbetello)瀉湖的沉積物中分離到的耐砷菌株主要是Aeromonas、Bacillus 和Pseudomonas。

C1-1 號樣品分離出的菌株大部分都是Bacillus，C1-1-4 菌株與從植物根部分離出的Paenibacillus(GU328691.1)的相似性最高，研究發(fā)現(xiàn)GU328691.1 菌具有固氮作用，可將大氣中的氮還原為氨，可能會使環(huán)境呈還原狀態(tài)而有助于高砷水形成。從SHY-12-1 號樣品中分離出的菌株不僅包括Bacillus，還包括兼性厭氧、容易在普通培養(yǎng)基上生長的Enterbacter，與Chitpirom 等[31]從皮革廢料和農(nóng)業(yè)土壤中分離出耐砷酸和亞砷酸的菌株Enterobacter 相符。

盡管3 個水樣的環(huán)境條件差異較大，但3 個點中，DB12086 號樣品中分離出Bacillales，其余2 點都分離出了Bacillus 菌，說明環(huán)境中可培養(yǎng)細(xì)菌主要是Bacillales，這與之前大部分研究結(jié)果很符合。過濾膜后在不同濃度砷的普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)，耐高濃度(150 mg·L-1)NaAsO2的主要是Enterbacter，而耐較低濃度(37 500 μg·L-1)的主要是 Pseudomonas，這個結(jié)果說明Enterbacter 可能對高砷地下水更適應(yīng)，對環(huán)境中砷遷移作用影響可能會更大。16S rDNA 基因序列分析能快速地對微生物進(jìn)行分類、鑒定。但由于實驗中未研究分離菌對砷的氧化或還原特性，因而只能初步確定其為耐砷菌，還不能確定其氧化還原性。

圖3 大同盆地高砷地下水中分離菌株的16S rDNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹注:采用鄰接法(N-J)法;括號內(nèi)為登錄號，節(jié)點只顯示＞50%的引導(dǎo)值。Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of culturable bacteria from high`arsenic groundwater in Datong Basin

綜上，通過添加外加砷源、稀釋培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)外加砷源對大同盆地高砷地下水中微生物數(shù)量有影響，表現(xiàn)低濃度(375 μg·L-1)的砷對微生物生長可能具有刺激作用，但是高濃度(37 500 μg·L-1)的砷則對大部分微生物生長呈現(xiàn)抑制作用。砷對微生物的數(shù)量產(chǎn)生影響，很可能同時會影響微生物的群落結(jié)構(gòu)及其功能，進(jìn)而影響微生物對有機(jī)物降解和營養(yǎng)元素吸收等作用，最終對砷的遷移和轉(zhuǎn)化等行為產(chǎn)生影響，因此微生物與外源砷之間是相互作用關(guān)系。

通過富集培養(yǎng)從高砷地下水中篩選出的耐高濃度NaAsO2的菌株，經(jīng)RDP 和16S rDNA 分析鑒定后發(fā)現(xiàn)，大同盆地地下水環(huán)境中可培養(yǎng)耐砷菌主要有Bacillus、Pseudomonas、Paenibacillus、Aeromonas和Enterobacter。不同砷含量地下水環(huán)境中可培養(yǎng)耐砷菌組成不同，但都可分離到生存能力強(qiáng)的Bacillales。主要的耐砷菌是γ-Proteobacteria，這類微生物很可能通過改變地下水中水化條件(如pH值)而促進(jìn)高砷地下水的形成。根據(jù)培養(yǎng)基中NaAsO2濃度的不同，耐高濃度(150 mg·L-1)砷的主要是Enterbacter，而耐較低濃度(37 500 μg·L-1)的則主要是Pseudomonas。

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